果蔬氧化還原防御系統(tǒng)研究進展

林少華，張曉軍，張慧杰，賈紅亮，潘 妍，羅紅霞*

（1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院食品與生物工程系，北京 102442；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；3.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津 300457）

蔬菜和水果的營養(yǎng)豐富，是人類所需的維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維等許多重要營養(yǎng)素的主要來源，也是人們?nèi)粘＝】碉嬍车闹匾M成部分。全球每年的水果和蔬菜總產(chǎn)量很高，但是由于它們存在季節(jié)性、地區(qū)性及易腐性，采摘后仍然進行著旺盛的代謝活動，在目前貯藏能力不足、關(guān)鍵技術(shù)缺乏、產(chǎn)業(yè)體系不健全等情況下，果蔬自身極易衰老變質(zhì)，并可能同時受到機械損傷、微生物侵染和冷害等威脅，降低了其食用品質(zhì)和商品價值，從而限制了果蔬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。隨著人們生活品質(zhì)的不斷提高，新鮮、健康、天然、營養(yǎng)的果蔬越來越受到人們的歡迎，需求量也越來越大，因此延緩果蔬衰老，抑制果蔬采后品質(zhì)下降是農(nóng)產(chǎn)品貯藏行業(yè)目前面臨的最大挑戰(zhàn)，而植物的氧化還原防御系統(tǒng)在調(diào)控果蔬衰老變質(zhì)過程中起到了非常重要的作用，植物體內(nèi)許多重要的細胞過程涉及氧化還原反應(yīng)，如分解代謝/合成代謝、蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化和應(yīng)激等[1]。

在大多數(shù)需要氧氣來維持生命的植物中，大部分生理代謝是依賴于氧化還原反應(yīng)來進行細胞的能量生產(chǎn)、細胞增殖、細胞分化和凋亡等。而參與這些過程的氧化劑和還原劑有輔酶（NAD+/NADH，NADP+/NADPH）、硫醇（谷胱甘肽）和活性氧（超氧陰離子、過氧化氫）、抗壞血酸等物質(zhì)[2]。尤其是作為還原劑的活性氧，對平衡植物氧化還原反應(yīng)和調(diào)控逆境脅迫抗性有重大影響。有研究表明植物體的衰老劣變與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的調(diào)節(jié)密切相關(guān)[3]。ROS 主要是指超氧陰離子自由基（O2-·）以及O2-衍生物質(zhì)，它是植物生理代謝的必然產(chǎn)物。當ROS 的產(chǎn)生超過植物的氧化防御范圍時，就會引起細胞損傷甚至死亡[4-5]。因此，清除果蔬體內(nèi)的ROS 是保持水果新鮮度和提高抗氧化能力不可分割的一部分。植物活性氧水平受多種因素影響，外源因素包括污染、輻射、煙草、外源性物質(zhì)，而內(nèi)源因素主要是由活性氧代謝轉(zhuǎn)化造成的。活性氧在多種組織細胞中產(chǎn)生，并與許多信號通路和相關(guān)酶反應(yīng)[6]。因此，探究果蔬采后氧化還原防御系統(tǒng)的作用機制和ROS 代謝的調(diào)控機理對貯藏保鮮精準控制技術(shù)的研究有重要意義，對延長果蔬貨架期、減少損失具有指導意義。

1 果蔬體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生及特點

活性氧（ROS）包括羥自由基（·OH）、超氧化物自由基（O2-·）、過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（1O2）、脂類過氧化物（ROO·）和烷自由基（R·）等類型[7]，是細胞在生理代謝過程中產(chǎn)生的一類含氧的、化學性質(zhì)活潑、存在時間短、氧化能力極強的代謝產(chǎn)物及其衍生物的總稱[8]。植物細胞在生物和非生物脅迫下，如衰老、干燥、冷害、高溫、病原微生物侵害等，在有氧呼吸和光合作用過程中通過O2的還原不斷產(chǎn)生ROS[9]。目前已在葉綠體、過氧化物酶體、線粒體等細胞內(nèi)以及植物細胞壁和質(zhì)膜等細胞外兩種途徑中檢測到ROS[10]。其中，細胞內(nèi)葉綠體活性氧主要通過類囊體、葉綠體基質(zhì)和黃素脫氫酶這3 個途徑產(chǎn)生，線粒體則主要是在內(nèi)膜上產(chǎn)生[11]。而在細胞外基質(zhì)產(chǎn)生活性氧的主要途徑是植物體內(nèi)細胞質(zhì)膜電子傳遞系統(tǒng)或質(zhì)膜氧化還原系統(tǒng)。

研究表明，少量的ROS 在植物發(fā)育中具有重要的生理作用[12]，可作為信號轉(zhuǎn)導分子控制細胞生長發(fā)育以及適應(yīng)環(huán)境變化等一系列生理過程，并可作為細胞壁松懈劑[13-14]。然而，活性氧是植物在成熟衰老過程中產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物，是一類能夠損傷細胞的毒性物質(zhì)，過量的ROS 會引起氧化應(yīng)激，導致蛋白質(zhì)變性損傷和脂質(zhì)過氧化以及DNA 損傷等多種不良反應(yīng)，參與果實衰老的特殊線粒體蛋白已被確定為ROS 的作用靶點[15]。研究還發(fā)現(xiàn)，ROS 會提高果蔬的呼吸強度，降低維生素C、總糖等營養(yǎng)物質(zhì)的含量，加速果肉軟化及自溶，從而降低硬度，促進果皮褐變進程[16]，因此，ROS 的大量積累是造成果蔬衰老、品質(zhì)下降的主要原因之一。用于檢測細胞內(nèi)ROS 含量的試劑有5-（和-6）-羧基-2’,7’-二氫二氟熒光素二乙酸酯（H2DFFDA）、二氫羅丹明甲酯（DHR123）、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）等。此外，基因編碼熒光蛋白指示劑已被開發(fā)用于體內(nèi)檢測細胞ROS 的變化，但存在蛋白質(zhì)表達困難、pH 敏感性強和細胞毒性大等缺點[17]。

2 果蔬的氧化還原防御系統(tǒng)及其作用機理

果蔬細胞中存在一套復雜完整的氧化還原防御系統(tǒng)（reduction oxidation system，redox-system），能夠調(diào)節(jié)細胞的氧化還原狀態(tài)。當植物體內(nèi)產(chǎn)生ROS 時，會自動激活這套氧化還原防御體系，通過增加抗壞血酸和還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）等抗氧化物質(zhì)的含量[18]，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化物酶的活性[19]，保護其不被ROS 損傷。這套系統(tǒng)包括酶促體系和非酶促體系[17]，當植物產(chǎn)生過多的ROS時，這兩套體系將會協(xié)同作用清除ROS，進而維持ROS產(chǎn)生與清除系統(tǒng)的平衡[8]。然而，在非生物因子逆境脅迫下，如高溫、機械損傷、病原菌侵染等，會干擾ROS-Redox 動態(tài)代謝平衡，導致ROS 的過度積累、相關(guān)內(nèi)源抗氧化物質(zhì)含量和ROS 清除酶活性下降，從而引起采后果蔬ROS 代謝失衡，進而加劇呼吸紊亂、生物膜功能喪失、能量供應(yīng)不足等問題[20]，使采后果蔬品質(zhì)劣變，嚴重影響其貯藏保鮮和銷售[7]。

2.1 酶促抗氧化系統(tǒng)

2.1.1 作用機理

酶促抗氧化系統(tǒng)主要通過SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、POD 和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等清除ROS[17,21]，因此，它們活性的高低對保持植物體內(nèi)ROS 的平衡十分重要。

SOD 分布于葉綠體、線粒體、細胞溶質(zhì)等多個部位，可以通過歧化反應(yīng)將O2-·催化成毒性較低的H2O2和O2，阻止·OH 的合成，以清除超氧自由基，CAT 協(xié)同SOD 進一步將H2O2轉(zhuǎn)化成為H2O 和O2，從而對氧化損傷起到防御作用[22]。CAT 和SOD 的協(xié)同催化反應(yīng)在防御超氧自由基損傷方面起著至關(guān)重要的作用[23]。超氧化物歧化酶的活性部位含有銅、鋅、錳三種不同金屬離子，作為其功能的輔助因子。其中，銅鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）存在于細胞質(zhì)、線粒體膜間隙和細胞核中，而錳超氧化物歧化酶（MnSOD）存在于線粒體基質(zhì)中[24]。

POD 普遍存在于植物細胞內(nèi)，含有一個Cys47 殘基，可被過氧化氫、脂質(zhì)過氧化物和過氧亞硝酸鹽等過氧化物底物氧化成半胱氨酸磺酸（Cys-SOH），Cys-SOH 在另一種過氧化物酶中進一步與Cys47-SH 相互作用形成二硫鍵[25]，并被谷胱甘肽等供體還原[26]。POD 既能在催化過程中產(chǎn)生自由基，加劇組織氧化，又能通過催化與CAT 協(xié)作將低濃度的H2O2分解并清除。研究發(fā)現(xiàn)，POD 可減少細胞溶質(zhì)和線粒體中約90%的H2O2[27]。

此外，APX 在抗壞血酸鹽的作用下，通過抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)反應(yīng)，可將抗壞血酸和H2O2轉(zhuǎn)化為水和脫氫抗壞血酸，還可協(xié)助POD、CAT 和酚類將H2O2還原為水，從而清除體內(nèi)的活性氧，緩解ROS 對機體的毒害作用[28]。GPX 作為一種含硒酶，在作為氫供體的條件下可以還原H2O2，維持細胞的正常生理功能[17]。GST 可以催化谷胱甘肽（GSH）與許多非極性小化合物（如醌類化合物）的結(jié)合，以抵御醌類化合物引起的氧化應(yīng)激[29]，在GSH 作為輔助因子的情況下，能夠?qū)⒂袡C過氧化氫還原為醇，并在抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[30]。低濃度ROS 可通過誘導脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）的降解、防御信號分子的生物合成以及植物抗性基因的表達，在植物體內(nèi)起到防御傷害的作用[31]。通常植物體內(nèi)的第一道抗氧化防線以SOD 對于超氧陰離子的轉(zhuǎn)化為主，第二道防線以CAT 和GPX 等酶的共同作用為主[10]。

2.1.2 果蔬酶促抗氧化的研究進展

活性氧在植物體內(nèi)的爆發(fā)在果實成熟衰老過程中扮演著重要作用，過量的活性氧累積會引起果實衰老或凋亡。由此，果實自身在應(yīng)對不同環(huán)境脅迫（冷害、病害、鹽脅迫、機械損傷等）會進行相應(yīng)的ROS 響應(yīng)，通過酶促抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮作用使細胞內(nèi)的ROS 水平得以平衡，以維持采后果實品質(zhì)[32]。大量研究表明，抗氧化劑系統(tǒng)能參與低溫脅迫下水果中活性氧的調(diào)控。Yoshihiro 等[33]通過將李子存儲在不同溫度下發(fā)現(xiàn)，6 ℃時李子過氧化氫含量高于1 ℃，且總抗氧化能力（TAC）、SOD、CAT、APX 的活性較低，導致6 ℃的果實具有更大的氧化應(yīng)激，從而冷害癥狀比在1 ℃下更為嚴重。Siboza 等[34]用茉莉酸甲酯（MJ）和水楊酸（SA）處理檸檬，可誘導其體內(nèi)酶促抗氧化劑的產(chǎn)生來增強果實的耐寒性，CAT、APX 和GR 等抗氧化酶參與了對MJ 和SA 處理檸檬的耐寒性傳遞。這一研究結(jié)果與Araújo 等[35]的結(jié)果相似，CAT 和APX 活性降低造成了H2O2的積累，酶促應(yīng)激誘導的CAT 和APX 活性增加在甘薯抑制H2O2含量中起著重要作用。

病害脅迫能夠?qū)呙割惪寡趸瘎┗钚援a(chǎn)生影響，從而對ROS 的積累產(chǎn)生影響。部建雯等[36]發(fā)現(xiàn)核盤菌接種之后的黃瓜體內(nèi)POD、SOD、APX 活性表達升高。王岳霞等[37]也認為青枯菌侵染茄子嫁接植株時，會使植株體內(nèi)超氧陰離子和H2O2積累，從而引發(fā)酶促抗氧化清除系統(tǒng)中CAT、SOD、POD、PPO、APX 以及GR 等抗氧化酶的活性增強以抵御病原菌侵害。龐強強等[38]發(fā)現(xiàn)高溫處理后的菜心體內(nèi)MDA 含量顯著升高，且POD、SOD、CAT等抗氧化酶的活性也增加，另外Mn-SOD、POD 和CAT基因表達量顯著增加。Maurer等[39]研究發(fā)現(xiàn)紫外線（UV-C）照射處理能夠促進葡萄的CAT、APX、GR 等抗氧化酶活性的提升，同時也提高了葡萄的抗氧化能力。陳存坤等[40]發(fā)現(xiàn)臭氧處理能誘導草莓的氧化防御系統(tǒng)，通過刺激酶促防御反應(yīng)中重要抗氧化酶（SOD、CAT、APX）活性的提高來應(yīng)對氧化脅迫，減少草莓中活性氧的積累。

2.2 非酶促抗氧化系統(tǒng)

植物體內(nèi)的非酶促抗氧化系統(tǒng)主要是指具有還原性等生物活性的、能與活性氧發(fā)生一系列反應(yīng)從而達到清除活性氧的物質(zhì)[10]。

2.2.1 作用機理

非酶促抗氧化系統(tǒng)主要包括還原性谷胱甘肽（GSH）和抗壞血酸（ASA）等幾十種化合物[7,17]。它們既可直接消除ROS，同時又可作為酶的底物在ROS清除中發(fā)揮作用[10]。植物體內(nèi)重要的非酶類抗氧化物質(zhì)主要是ASA 與GSH，它們能夠在逆境脅迫過程中直接清除植物體內(nèi)過量的·OH、O2-·和H2O2等活性氧物質(zhì)，或通過ASA-GSH 循環(huán)途徑的偶聯(lián)反應(yīng)將活性氧還原為水或醇等不易揮發(fā)的化合物[41-42]，以有效減少細胞內(nèi)MDA 的積累，保護膜結(jié)構(gòu)并修復自由基引起的氧化損傷，使植物在一定程度上抵抗逆境脅迫，從而延緩果蔬組織的衰老進程[7,43-45]。此外，谷胱甘肽還原酶和抗壞血酸過氧化物酶的協(xié)同作用能夠確保內(nèi)源性谷胱甘肽和抗壞血酸在植物細胞內(nèi)維持抗氧化系統(tǒng)高效運行所需的高水平[46]?？箟难峥赏ㄟ^降低MDA 的含量，抑制膜脂過氧化作用[22]。GSH 是細胞內(nèi)主要的含巰基化合物，除了直接清除自由基之外，還可作為SOD、CAT 和APX 等抗氧化酶的輔助因子，保持蛋白質(zhì)巰基處于還原狀態(tài)，并再生抗壞血酸等抗氧化劑的活性形式[47]。因此，GSH 氧化是非生物脅迫的一個生化特征，其通過谷胱甘肽還原酶活性的再生在清除ROS 中起到非常重要的作用[42]。

2.2.2 果蔬非酶促抗氧化的研究進展

果蔬氧化還原防御系統(tǒng)不僅包括酶促反應(yīng)，同時還存在非酶促反應(yīng)。當活性氧的積累與代謝失衡造成果蔬衰老腐敗時，非酶促反應(yīng)在平衡氧化還原方面同樣起重要作用，它通過與酶促反應(yīng)的協(xié)同作用直接或間接達到清除過量活性氧的目的，使植物細胞內(nèi)的活性氧產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡。

抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（AsA-GSH）是近年來的研究熱點，該循環(huán)對活性氧的清除有重要作用。特別是在CAT 不足的情況下，果蔬細胞中產(chǎn)生的H2O2主要是由ASA-GSH 循環(huán)清除[48]。Ali 等[49]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過臭氧熏蒸的番木瓜非酶促抗氧化系統(tǒng)中抗壞血酸、β-胡蘿卜素、總酚含量增加，尤其是抗壞血酸。Hasan 等[50]發(fā)現(xiàn)外源性GSH 處理番茄能顯著減少ROS 的積累、增加一氧化氮（NO） 和亞硝基硫醇（SNO） 的含量，并通過平衡ASA-GSH 循環(huán)，利用氧化還原機制刺激抗氧化系統(tǒng)，以此提高番茄對鎘（Cd）脅迫的耐受性。Zhang 等[48]研究也發(fā)現(xiàn)臭氧處理可通過提高草莓ASA 和GSH 的累積提高超氧陰離子、過氧化氫的清除效率，維持采后草莓品質(zhì)。此外，楊乾等[51]發(fā)現(xiàn)水楊酸處理誘導了采后甜瓜果實ASA和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量的增加，從而抑制了丙二醛（MDA）的產(chǎn)生，清除過量的過氧化氫，有效防止了細胞膜脂過氧化。林藝芬[52]在用外源H2O2處理采后龍眼的研究中發(fā)現(xiàn)，H2O2促進果實果皮中抗氧化物質(zhì)ASA、GSH、類黃酮與類胡蘿卜素的降解，加速了采后O2-·產(chǎn)生速率和MDA 含量的上升，促進了ROS 的氧化爆發(fā)，最終導致果實和果皮褐變。胡花麗等[53]研究發(fā)現(xiàn)延緩獼猴桃的衰老機理與其維持果實較高的ASA 和GSH 有關(guān)，2%O2＋3%CO2氣調(diào)處理有利于提高果實的ASA 和GSH 含量，清除O2-·產(chǎn)生速率和DPPH 自由基，有利于再建果實氧化還原的穩(wěn)態(tài)，從而延緩獼猴桃的衰老進程。

3 保鮮技術(shù)對果蔬采后ROS 清除的影響

根據(jù)果蔬氧化還原防御系統(tǒng)的要求，只要能夠清除果蔬ROS 或提升酶促或非酶促抗氧化體系，均能夠減少采后果蔬的品質(zhì)劣變，延長貯藏保鮮時間。近年來，國內(nèi)外開發(fā)了許多安全且具有干預果蔬氧化還原防御系統(tǒng)功能的保鮮技術(shù)。如采用酸性氧化電位水對藍莓進行處理后，能夠調(diào)節(jié)ROS 代謝并減少其積累，提高SOD、CAT 和APX 的活性，從而降低果實腐爛率[54]。納米復合包裝材料也能減少ROS 的產(chǎn)生，抑制金針菇的呼吸作用和失重率、保持其貨架品質(zhì)[55]。臭氧（O3）已被證明在農(nóng)產(chǎn)品儲存方面發(fā)揮了積極的作用，能夠降低O2-·和H2O2的含量，提高SOD、CAT、APX 及單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）的活性，促進ASA 和GSH 的積累，改變相關(guān)抗氧化基因和蛋白的表達[56-57]。此外，外源ROS 清除劑、植物提取物和冰溫貯藏等保鮮方法也能較好地減少ROS 的積累，改善果蔬的貯藏品質(zhì)并延長貯藏時間。

4 結(jié)論與展望

果蔬的成熟和衰老過程與活性氧的積累有關(guān)，也與其體內(nèi)許多重要的酶促和非酶促抗氧化體系有關(guān)。雖然這些體系可以使果蔬在成熟衰老初期保持氧化還原處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但在成熟衰老的代謝和結(jié)構(gòu)分解過程中，果蔬仍會發(fā)生不可逆的氧化應(yīng)激反應(yīng)。因此，抗氧化化合物含量和抗氧化酶活性對延長果蔬貯藏期具有重要作用，對它們的調(diào)控研究已經(jīng)成為國內(nèi)外果蔬采后的重點和熱點。近年來，通過臭氧、包裝材料、天然植物提取物和冰溫貯藏等果蔬采后品質(zhì)控制技術(shù)，能夠有效地控制活性氧的產(chǎn)生和積累，延緩果蔬的衰老變質(zhì)，延長保鮮期和銷售期。

隨著分子生物學和檢測技術(shù)的發(fā)展和成熟，果蔬氧化還原防御系統(tǒng)的研究方向主要有以下幾點：通過進一步深入研究果蔬ROS 產(chǎn)生的機理及氧化還原防御系統(tǒng)的機制，從而開發(fā)出更多高效清除ROS、提高抗氧化活性的技術(shù)和方法；通過進一步探究果蔬不同處理對于觸發(fā)抗氧化機制的共同點，解析果蔬氧化還原系統(tǒng)激活的調(diào)控因素；通過進一步開展采后領(lǐng)域果蔬的活性氧代謝與其生理品質(zhì)之間的相互作用關(guān)系研究，為采后果蔬保鮮新技術(shù)的開發(fā)提供理論參考；通過開展多學科交叉探究ROS 代謝與果蔬衰老之間的關(guān)系，如分子生物學在果蔬逆境脅迫與ROS 代謝機制方面的系統(tǒng)研究和應(yīng)用，將對果蔬采后貯藏保鮮具有重要意義。