腸道病毒71 型疫苗研究進展

畢方川綜述 許紅梅審校

重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院感染科 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室 國家兒童健康與疾病臨床 醫(yī)學研究中心 兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地 兒科學重慶市重點實驗室（重慶 400014）

手足口?。╤and,foot,and mouth disease，HFMD）是一種常見的兒童傳染性疾病，其特征表現(xiàn)為發(fā)熱，口腔后部多發(fā)潰瘍及手、足底、臀部丘疹或皰疹，部分危重患兒可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、急性弛緩性癱瘓、腦干腦炎、肺水腫、心肺衰竭等嚴重并發(fā)癥[1]。HFMD具有高度傳染性，可通過糞-口途徑、直接接觸、間接接觸及呼吸道飛沫等途徑進行傳播[2]。HFMD通常發(fā)生于5歲以下兒童，全年均可發(fā)生，具有明顯的季節(jié)分布特點。每年4～8 月份和9～12 月份為亞太地區(qū)HFMD流行高峰期[3]。

HFMD 的致病原為腸道病毒，屬小RNA 病毒科腸道病毒屬，主要有柯薩奇病毒（Coxsackieviru，CV）A 組的4、5、6、7、9、10、16 型和B 組的1、2、3、5 型，?？刹《荆‥chovirus）的部分血清型和腸道病毒71型（Enterovirus A71，EV-A71）等。EV-A71具有較強的嗜神經毒性，易引發(fā)嚴重的神經系統(tǒng)并發(fā)癥，是造成重癥HFMD的主要病原[4]。

1 EV-A71的流行病學

1969年EV-A71首次在美國加利福尼亞的神經系統(tǒng)感染患兒糞便中被分離。20世紀70年代，澳大利亞、日本相繼報道EV-A71流行爆發(fā)，隨后馬來西亞（1986年）、中國臺灣（1998年）、中國大陸（2008年）先后報道EV-A 71 相關的HFMD 重大疫情[5]。此外，許多亞太地區(qū)國家每2～3 年會經歷一次周期性的EV-A 71 爆發(fā)。

EV-A 71 分為A、B、C 基因組。A 組為原型EVA 71 病毒株（BrCr-CA-70），B 組分為B 1～B 5 五種亞基因型，C 組分為C 1～C 5 五種亞基因型[6]。1997 年后亞太地區(qū)流行的EV-A71以B、C組為主，主要包括B3～B5、C1～C4；1963年至1990年期間，歐美地區(qū)流行的EV-A71以B1、B2為主，1990年以后逐漸被C組替代，此后C1、C2成為歐美地區(qū)的主要基因型別[7]。

2 EV-A71的結構

EV-A71是無包膜小RNA病毒，直徑24～30 nm。EV-A 71 基因組為單股正鏈RNA，大約由7 411 個核苷酸組成，具有一個完整的開放編碼框，可編碼大約含2 100 個氨基酸的蛋白，該蛋白可進一步形成P 1、P2、P3三種前體蛋白。P1前體蛋白可裂解形成VP0、VP1、VP3蛋白，VP0進一步裂解形成VP2和VP4蛋白，VP 1、VP 2、VP 3、VP 4 屬于結構蛋白，構成病毒衣殼，主要參與免疫應答。P2、P 3 前體蛋白裂解形成2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D共7種非結構蛋白[8]，主要控制病毒的復制和毒力。開放閱讀框的兩側是5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)，5’非編碼區(qū)參與基因復制、翻譯[6]。EV-A71病毒衣殼由60個結構蛋白原聚體組成，包含VP1、VP2、VP3和VP4四種結構蛋白，VP1、VP2及VP3位于衣殼外部，VP4位于衣殼內部[8]。

3 EV-A71疫苗

在研的EV-A 71 疫苗包括滅活全病毒疫苗、減毒活疫苗、病毒樣顆粒疫苗、重組VP1蛋白疫苗和合成多肽疫苗。目前僅有滅活EV-A71全病毒疫苗完成Ⅲ期臨床試驗并已廣泛應用。

3.1 滅活全病毒疫苗

滅活全病毒疫苗是利用理化方法處理人工大量培養(yǎng)的完整病毒，使其喪失感染性和毒性而保持其免疫原性，并結合相應的佐劑而制成的疫苗。迄今為止，中國大陸、中國臺灣、新加坡已開發(fā)了完整的滅活全病毒EV-A71疫苗。

科興生物技術有限公司（Sinovac）、微谷生物技術有限公司（Vigoo）和中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所（CAMS）于2010年至2011年完成滅活全病毒EVA71疫苗的Ⅰ期臨床試驗，于2013年完成Ⅲ期臨床試驗，并于2015年獲得中國食品藥品監(jiān)督管理局的批準正式投入使用。這三個單位使用不同的病毒株開發(fā)疫苗，分別為：H 07 菌株、FY 7 VP 5 菌株、FY-23 菌株，均屬于EV-A71 C4亞型，是中國最常見的EV-71A亞型。CAMS使用KMB-17人類二倍體細胞作為細胞庫使用細胞工廠擴增EV-A71病毒，Vigoo和Sinovac使用Vero 細胞作為細胞庫分別通過微載體生物反應器和細胞工廠擴增EV-A71病毒。三個單位均使用甲醛滅活EV-A71病毒，并添加鋁明礬佐劑來制備EV-A71滅活全病毒疫苗。

Sinovac的Ⅲ期臨床試驗納入10 077名6～35月齡的嬰幼兒，隨機接受400 U 滅活EV-A 71 全病毒疫苗（5 044名）或安慰劑（5 033名，ClinicalTrials.gov，編號NCT01507857）。在第1年監(jiān)測期內，其針對EV-A71相關HFMD 或皰疹性咽峽炎的保護率為94.8%，針對EV-A71相關的住院及神經系統(tǒng)并發(fā)癥的保護率為100%[9]。其中9 595 名嬰幼兒繼續(xù)隨訪，第2 年針對EV-A71相關疾病的保護率為95.1%，且兩年總體保護率為94.7%。同時還證實，接種疫苗后能針對EVA71不同基因型（B4、B5、C2和C5型）產生交叉免疫，但對CV-A 16 等其他腸病毒相關的HFMD 保護率僅為6.8%，不具備交叉保護能力[10]。其中343名受試者繼續(xù)隨訪至5年，仍具有較高滴度的特異性免疫抗體，提示Sinovac EV-A71疫苗具有長期的免疫持久性[11]。兩組受試者產生的不良反應相似，最常見的全身不良反應為發(fā)熱、腹瀉和食欲不振，最常見的注射部位不良反應是局部發(fā)紅、硬化和疼痛。實驗期間，共報道242例嚴重疫苗接種不良事件（疫苗組111例、發(fā)生率2.2%，對照組131 例、發(fā)生率2.6%），但沒有受試者因接種疫苗死亡，提示該疫苗具有良好的安全性[9]。

Vigoo 的Ⅲ期臨床試驗納入10 245 名6～35 月齡嬰幼兒，分別接受320 U 滅活EV-A 71 全病毒疫苗（5 120 名）或安慰劑（5 125 名，ClinicalTrials.gov，編號NCT 01508247）。在1 年的監(jiān)測期內，其針對 EV-A 71 相關HFMD 的疫苗效力為90%，針對其他EV-A71相關疾病的疫苗效力為80.4%[12]；在第2年的隨訪中，針對EV-A 71 相關HFMD 的兩年總體疫苗效力為94.42%，第2 年疫苗效力為100%，提示該疫苗能提供持續(xù)的保護[13]。實驗期間，疫苗組有62例（1.2%）出現(xiàn)嚴重的不良事件，安慰劑組有75 例（1.5%），兩組嚴重不良事件發(fā)生率無顯著差異[12]。

CAMS 的Ⅲ期臨床試驗納入12 000 名6～71 月齡嬰幼兒，分別接受100 U 的滅活EV-A 71 全病毒疫苗（6 000名）或安慰劑（6 000名，ClinicalTrials.gov，編號NCT 01569581）。在第1 年的監(jiān)測期內，其針對 EV-A 71 相關HFMD 的疫苗效力為97.4%，對CVA16等其他腸病毒引起的HFMD不具有保護作用[14]。

中國臺灣研制的滅活EV-A 71 全病毒疫苗采用EV-A 71 臨床分離株E 59 菌株（B 4 亞型）[15]。于2019 年啟動Ⅲ期臨床試驗（ClinicalTrials.gov，編號NCT03865238），預計將于2022年完成。新加坡使用B3亞型，已完成Ⅰ期臨床研究[16]。

以上研究表明，滅活EV-A 71 全病毒疫苗具有良好的保護性和安全性，但僅能預防部分EV-A71感染，仍需進行進一步研究。

3.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗是通過將微生物的自然強毒株通過物理、化學或生物學等方法進行處理而制成的疫苗，減毒活疫苗喪失致病力或只引起亞臨床感染，但仍保持良好的免疫原性。

研究者參照脊髓灰質炎病毒減毒的策略對 EV-A 71 BrCr 株基因組5’非編碼區(qū)、3 D基因和3’非編碼區(qū)進行變異，得到EV-A 71 減毒株（S 1-3’）。接種了EV-A 71（S 1-3’）的食蟹猴可在致死劑量的 EV-A 71 攻擊下存活，產生針對EV-A 71 不同基因型（A、B1、B4、C2和C4型）的中和抗體，但部分猴子接種疫苗后出現(xiàn)震顫，并在脊髓中分離出減毒病毒[17]。研究表明，EV-A71減毒活疫苗是可行的，但應該進一步改善疫苗的安全性。近年來出現(xiàn)了一種使用密碼子去優(yōu)化病毒制備減毒疫苗的方法，研究者將病毒特定氨基酸對應優(yōu)選密碼子替換為與之對應的最不優(yōu)選密碼子，使其雙核苷酸CpG和UpA水平升高，從而降低病毒的毒力及生存能力[18]。研究顯示，通過對病毒3D RNA聚合酶的L123F和G64R兩處氨基酸位點進行修飾，構建高保真的EV-A 71 減毒株，接種該減毒株小鼠產生針對EV-A71的特異性中和抗體且未產生體質量減輕、癱瘓、死亡等嚴重不良反應。提示該減毒株具有較高的免疫原性及較低的毒力[19]。密碼子去優(yōu)化是一種開發(fā)安全穩(wěn)定的減毒疫苗的新方法。

3.3 病毒樣顆粒疫苗

病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）是由病毒單一或多個結構蛋白自行裝配而成的高度結構化的蛋白質顆粒，在形態(tài)特征和抗原性上與天然病毒顆粒相似，具備激發(fā)宿主免疫反應的能力。VLP 不含病毒基因組，不能自發(fā)復制感染，是構建候選疫苗的安全 之選。

基于制備脊髓灰質炎病毒VLP疫苗的經驗，可構建昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)，制備EV-A71 B5亞型VLP疫苗。該疫苗能誘導恒河猴產生高水平的針對EV-A71不同亞型（B4、B5、C2和C4亞基因型）的特異性抗EV-A71病毒IgG和IgM，阻止EV-A71在恒河猴中傳播[20]。除桿狀病毒表達系統(tǒng)外，EV-A71 VLP 還可以在酵母中產生，使用畢赤酵母表達EV-A 71 VLP，能有效誘導小鼠產生針對同源和異源EV-A 71株的中和抗體，還能通過母體免疫保護新生小鼠免于EV-A71攻擊[21]。EV-A71 VLP疫苗具有良好的保護效果，具較高安全性且易于制備，是優(yōu)質的EV-A71候選疫苗，但VLP疫苗的生產成本較高，產量相對較低，仍需進一步改進。

3.4 重組VP1蛋白疫苗

病原體引起免疫反應的主要成分是抗原蛋白上的抗原決定簇，抗原決定簇是由數(shù)量不等的抗原表位組成。EV-A71的主要抗原表位大多位于VP1蛋白。

將重組桿狀病毒Bac-Pie1-gp64-VP1轉入昆蟲細胞后成功表達了C4亞基因EV-A71的VP1，這種VP1蛋白與原始病毒VP 1 蛋白具有相同的形態(tài)結構及免疫原性。小鼠接種這種重組蛋白后能產生高滴度的針對EV-A71病毒所有基因亞型的中和抗體[22]。研究顯示，通過基因重組技術獲得包含gag蛋白（人免疫缺陷病毒結構性多蛋白Pr 55 gag 的前體蛋白）和EV-A 71 VP1 蛋白的VLP（gag-VP1 VLP）。這種疫苗能誘導小鼠產生強烈的體液和細胞免疫反應，還能通過母體免疫保護新生小鼠免受致命劑量EV-A71的攻擊[23]。以上研究表明，重組VP1蛋白疫苗能同時誘導體液和細胞免疫應答，并能對不同亞基因型的EV-A71產生交叉中和作用，具有較好的發(fā)展前景。但VP1蛋白疫苗的保護作用仍需進一步強化。

3.5 合成肽疫苗

合成肽疫苗是根據(jù)病原體抗原表位或者抗原決定簇氨基酸序列特點而開發(fā)設計的一類疫苗。這種疫苗通過人工合成病原微生物的保護性多肽或抗原表位，并輔以適當?shù)妮d體與佐劑而制成的一種新型基因工程疫苗。

EV-A 71 病毒上的多肽SP 70 位于VP 1 蛋白，是EV-A71的主要中和表位的重要組成之一。研究顯示，利用B 4 亞基因型EV-A 71 的SP 70 免疫小鼠，小鼠可產生同原病毒免疫相似效價的特異性IgG，且能對B2、B5、C2、C4亞基因型病毒產生交叉免疫反應[24]?？筍P70血清能對同源及異源EV-A71（B2、B4、B5、C2、C4）的攻擊提供較強的保護作用[25]。

研究發(fā)現(xiàn)，CV-A16抗原表位PEP71能誘導小鼠產生針對同源和異源CV-A 16 菌株的中和抗體；且CV-A16 的SP70肽的氨基酸排列與PEP71高度重疊，提示SP 70 可能同樣具有開發(fā)通用CV-A 16 疫苗的潛力[26]?；诖搜芯浚瑢V-A 71 VLP 中的SP 70 肽替換為CV-A 16 的SP 70 肽，設計一個嵌合的EV-A 71 VLP（ChiEV-A71 VLP）。這種疫苗能誘導小鼠產生針對EV-A 71 和CV-A 16 的特異性體液免疫，還能誘導小鼠脾細胞IFN-c，IL-2，IL-4和IL-6顯著升高，激活小鼠針對EV-A71的有效細胞免疫應答；小鼠注射抗ChiEV-A71血清后可在致死量的EV-A71和 CV-A16攻擊下存活。研究提示，抗ChiEV-A71血清能同時具有針對EV-A71和CV-A16感染的保護作用[27]。

合成肽疫苗具有較高的特異性、較好的免疫原性和保護性。通過研究不同抗原肽的保護作用，并選擇不同抗原肽嵌合腸道病毒VLP 制備疫苗的方法可能是制備多價HFMD疫苗的新思路。

綜上，EV-A 71 是最具致病性的腸道病毒之一，雖然我國研發(fā)的EV-A71滅活疫苗已批準上市，但該疫苗仍需進行進一步的遠期評估。同時也要繼續(xù)深入研究減毒活疫苗，病毒樣顆粒疫苗、重組VP1蛋白疫苗、合成多肽疫苗等新型疫苗，需在保證疫苗安全性的前提下，進一步提高其保護效力及生產能力。同時，除EV-A 71 以外，CV-A 16 和近年來新興的腸道病毒如CV-A6、CV-A8和CV-A10等也與HFMD的暴發(fā)有關[28-30]。因此研制預防多種腸道病毒感染的聯(lián)合疫苗將是預防HFMD疫苗的重要研究方向。