Janus激酶2在腫瘤化療耐藥中的作用及在伊馬替尼耐藥胃腸間質(zhì)瘤中的潛在應(yīng)用價值▲

黃梓祥 李澤倫 王曉通 鐘曉剛

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，南寧市 530021，電子郵箱：981888025@qq.com)

【提要】 Janus激酶2(JAK2)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)是近年來受到學(xué)者們廣泛關(guān)注的細胞內(nèi)信號通路之一，其能快速將受體收到的膜外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核內(nèi)，進而調(diào)控下游基因的表達，參與多種細胞功能和行為。隨著分子生物學(xué)研究深入，STAT3在多種癌癥中的異常激活被人們所認識，作為STAT3主要上游激活分子，JAK2在腫瘤中的作用也逐漸受到重視。已有研究表明，JAK2/STAT3通路還參與了多種腫瘤化療耐藥的相關(guān)過程，這為解決腫瘤對靶向藥物耐藥的問題提供了新的思路。隨著伊馬替尼的臨床應(yīng)用，胃腸間質(zhì)瘤(GIST)的治療效果取得了很大改善，但仍有半數(shù)以上GIST患者因耐藥而出現(xiàn)治療失敗。針對伊馬替尼耐藥GIST，各國研究者們?nèi)栽诓粩嗯ふ医鉀Q方案，而目前對JAK2是否參與伊馬替尼耐藥所知甚少。故本文就JAK2在惡性腫瘤化療耐藥性中的作用及其在伊馬替尼耐藥GIST中的潛在價值研究進展進行綜述。

Janus激酶(Janus kinase，JAK)2是JAK家族中的一員，除JAK3僅存在于骨髓和淋巴系統(tǒng)外，其余JAK家族成員則廣泛存在于各種組織和細胞中。研究表明，敲除JAK2的等位基因能導(dǎo)致胚胎致死性的造血功能缺失[1]。JAK/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)是一條轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細胞功能的信號通路，目前在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的STAT家族成員有7個，即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT6、STAT5a和STAT5b[2]。在細胞因子(生長因子、炎癥因子)的誘導(dǎo)下，上游共有激酶JAK與細胞質(zhì)中特異性受體產(chǎn)生的優(yōu)勢位點融合，受體與JAK發(fā)生聚合反應(yīng)，引起JAK激酶C端的酪氨酸殘基磷酸化而發(fā)生活化；活化的JAK蛋白在細胞質(zhì)中募集信號分子STAT，并識別STAT家族蛋白的SH2功能結(jié)構(gòu)域，在SH2結(jié)構(gòu)域的幫助下，兩個STAT蛋白相互靠近、發(fā)生磷酸化并進入細胞核內(nèi)，在細胞核內(nèi)與相關(guān)基因的啟動子結(jié)合后，直接激活靶基因，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[3]。生理情況下STAT酪氨酸磷酸化是暫時的，但在許多癌細胞及腫瘤衍生細胞中，其磷酸化處于持續(xù)激活的失控狀態(tài)[4]。許多細胞因子如干擾素家族、γ-C家族和單鏈家族可激活JAK/STAT信號通路，該通路已被認為是與細胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)乃至腫瘤發(fā)生有關(guān)的重要信號通路[5]。

1 JAK2在腫瘤耐藥性中的作用

目前已有大量研究表明，STAT3的激活在肺癌[6]、乳腺癌[7]、鼻咽癌[8]、結(jié)直腸癌[9]等許多實體瘤中很常見，是許多典型的癌基因誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化的必經(jīng)過程[10]。而作為STAT3的主要上游激活分子，JAK2不僅參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，還與腫瘤的侵襲和耐藥性有關(guān)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)JAK2的表達下調(diào)致使下游分子STAT3表達下調(diào)，對腫瘤細胞的遷移和侵襲有明顯的抑制作用[6]。

1.1 非小細胞肺癌 肺癌是我國最常見的癌癥死亡原因，國內(nèi)外肺癌的發(fā)病率和死亡率均呈快速增長。超過四分之一的非小細胞肺癌患者存在表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突變，采用抑制劑(如厄洛替尼)可有效抑制EGFR激活并阻斷下游信號通路，但隨著治療時間增加，多數(shù)患者出現(xiàn)耐藥導(dǎo)致治療失敗[11]。研究表明，STAT介導(dǎo)的蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)活化導(dǎo)致肺癌細胞對厄洛替尼耐藥。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)JAK2抑制劑TG101348可顯著增強厄洛替尼對EGFR基因突變型非小細胞肺癌細胞增殖的抑制作用，其作用機制在于TG101348明顯降低了磷酸化EGFR、磷酸化STAT3和Survivin的表達。以往的研究表明，EGFR能夠上調(diào)Survivin的表達，而Survivin已被證明與非小細胞肺癌厄洛替尼耐藥有關(guān)[13]，Survivin是磷酸化STAT3和EGFR的下游激活物之一，所以JAK2抑制劑通過抑制STAT3的激活，誘導(dǎo)細胞凋亡，增強厄洛替尼對EGFR突變型非小細胞肺癌細胞的抗腫瘤作用，逆轉(zhuǎn)了腫瘤對厄洛替尼耐藥性。Harada等[14]通過培育非小細胞肺癌耐藥細胞株pc-9/er3，并用JAK2抑制劑聯(lián)合厄洛替尼處理，發(fā)現(xiàn)耐藥細胞株恢復(fù)了對厄洛替尼的敏感性。由此可見，JAK2/STAT3信號通路的激活是非小細胞腫癌細胞對厄洛替尼獲得性耐藥的部分原因，而厄洛替尼與JAK2抑制劑聯(lián)合治療可以克服這一現(xiàn)象。

1.2 慢性粒細胞白血病 慢性粒細胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)是一種由于t(9；22)費城染色體畸變引起的克隆性疾病。由Bcr-Abl融合基因產(chǎn)生的特定mRNA編碼異常的酪氨酸激酶活性蛋白，激活了下游多種轉(zhuǎn)錄因子和基因啟動子，從而在腫瘤的轉(zhuǎn)化和增殖中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。伊馬替尼是治療CML的一線藥物，但在治療過程中同樣不可避免出現(xiàn)伊馬替尼耐藥的問題，這可能與靜止的CML干細胞有關(guān)[15]。Okabe等[16]發(fā)現(xiàn)，單用伊馬替尼可明顯抑制Bcr-Abl陽性的白血病細胞株K562增殖，但在人骨髓基質(zhì)細胞系HS-5存在的條件下，只能達到部分抑制的作用，而在含HS-5細胞的條件培養(yǎng)基中伊馬替尼聯(lián)合JAK2抑制劑TG101348則可抑制K562細胞的增殖，這是因為HS-5細胞可分泌多種細胞因子，從而保護CML細胞不受伊馬替尼侵襲，JAK2則是這些細胞因子通路中的關(guān)鍵。有學(xué)者采用干擾RNA技術(shù)制備JAK2低表達的CML細胞，發(fā)現(xiàn)與空白對照組比較，JAK2低表達的CML細胞的Bcr-Abl磷酸化水平?jīng)]有降低，而采用伊馬替尼處理后Bcr-Abl的下游分子Crk-L和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化減少，這提示JAK2參與了Bcr-Abl的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。由此可知，在存在HS-5細胞的環(huán)境中伊馬替尼單藥治療無法消除靜止CML細胞，而JAK2抑制劑聯(lián)合伊馬替尼共同阻斷細胞信號通路可能是消除殘余CML細胞的一種有效的治療策略。

1.3 卵巢癌 卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)的常見癌癥，復(fù)發(fā)率高，復(fù)發(fā)后的癌細胞可能出現(xiàn)對紫杉醇耐藥，導(dǎo)致化療失敗。在卵巢癌耐藥機制中，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換具有關(guān)鍵作用：在腫瘤炎癥性微環(huán)境中，間充質(zhì)細胞的主要成分是腫瘤相關(guān)成纖維細胞，而后者可通過自分泌或旁分泌的方式分泌多種炎性細胞因子，參與卵巢癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和化療的耐藥。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關(guān)成纖維細胞產(chǎn)生的白細胞介素6在細胞膜與相關(guān)受體結(jié)合，激活JAK2/STAT3的下游通路，從而調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換相關(guān)基因和其他基因的表達。張晶晶[18]檢測卵巢癌細胞株OC3及紫杉醇耐藥細胞株OC3/TAX300中JAK2 mRNA和蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)耐藥細胞株OC3/TAX300的JAK2 mRNA表達水平明顯高于敏感細胞株；采用含JAK2拮抗劑AG490的溶液對耐藥細胞株OC3/TAX30進行培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，細胞中JAK2及STAT3的mRNA和蛋白表達水平隨AG490濃度的升高而下降，且耐藥細胞株OC3/TAX30對紫杉醇的敏感性增加，細胞周期G2/M比例明顯升高。由此得知，JAK2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與卵巢癌細胞的生長、發(fā)展及耐藥性密切相關(guān)，AG490可有效抑制JAK2及STAT3 mRNA和蛋白在卵巢癌耐藥細胞中的表達，并且增強耐藥細胞對紫杉醇的藥物敏感性。進一步研究JAK2在卵巢癌中的作用，有助于我們深入了解該病的發(fā)生和發(fā)展機制，也可為治療該病提供更好的思路。

1.4 胰腺癌 胰腺癌是一種預(yù)后較差的侵襲性惡性腫瘤，具有生存期短、轉(zhuǎn)移早、死亡率高、化療耐藥等特點，臨床治療一般以外科手術(shù)為主，但只有少數(shù)患者能夠耐受手術(shù)，而對于不能進行手術(shù)的患者則采取順鉑、吉西他濱等化療或局部放射治療[19-21]。近年來，胰腺癌基因?qū)用娴难芯咳〉靡欢ㄟM展。組蛋白去乙?；敢种苿┦且环N具有干擾組蛋白去乙酰化酶功能的抑制劑，通過介導(dǎo)組蛋白和非組蛋白的有絲分裂缺陷發(fā)揮抗癌作用，是對胰腺癌、肺癌等多種癌癥有效的抗癌藥物[19，22]。但有研究表明，胰腺癌細胞對組蛋白去乙?；敢种苿┣琶顾谹有耐藥性[23]。Zhang等[24]發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者體內(nèi)JAK2/STAT3信號上游分子白細胞介素6水平增高，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和血管浸潤呈正相關(guān)；與非耐藥細胞株P(guān)ANC-1相比，曲古霉素A耐藥細胞株中的STAT3磷酸化水平明顯升高，且其下游靶基因(如c-Myc、c-Src及CCND1)的表達明顯升高；高劑量(≥30 μmol/L)的AG490對JAK2/STAT3下游靶基因的表達有明顯的抑制作用，并降低曲古霉素A介導(dǎo)的胰腺癌細胞耐藥性。這提示了曲古霉素A可能激活白細胞介素6/JAK2/STAT3信號通路，導(dǎo)致STAT3過表達，從而產(chǎn)生耐藥。值得注意的是，AG490還能抑制非耐藥胰腺癌細胞中的c-Src mRNA的表達[24]，這提示AG490不僅可以逆轉(zhuǎn)曲古霉素A介導(dǎo)的耐藥，還可能對胰腺癌有潛在的治療作用。

2 胃腸間質(zhì)瘤概述

早在1983年，胃腸間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumor，GIST)的概念就已被提出，它是一種罕見的腫瘤，但卻是最常見的胃腸道間充質(zhì)腫瘤，臨床癥狀出現(xiàn)晚且無特異性，發(fā)病范圍廣泛，可發(fā)生于胃腸道和腹腔任何部位，多見于胃(占60%，中老年人群中胃小間質(zhì)瘤常見)，其次是小腸(占30%)，常被誤診而導(dǎo)致治療延誤[25]。

大約60%的局限性GIST患者可經(jīng)手術(shù)治愈，為降低復(fù)發(fā)率，術(shù)中應(yīng)做到肉眼及顯微鏡下不破壞腫瘤包膜完整切除腫瘤。術(shù)前可根據(jù)情況采用伊馬替尼新輔助治療以縮小腫瘤體積，避免過大的損傷范圍。但即便是手術(shù)R0切除的患者，仍有85%的患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，5年累積總生存率僅50%～65%，5年無復(fù)發(fā)生存率低至20%～40%[26-28]。近年來的研究顯示，GIST患者普遍存在KIT基因(占75%～80%)或血小板源性生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)α(占5%～10%)突變。這些受體的激活誘導(dǎo)了與GIST發(fā)病有關(guān)的多種信號通路，包括Ras/Raf/MAPK和磷脂?；?-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路[29]，從而使得細胞增殖失控，促進腫瘤的發(fā)生和進展，這一發(fā)現(xiàn)意義重大，將GIST的治療提升至靶向藥物時代。伊馬替尼作為KIT和PDGFR的選擇性抑制劑，于2002年2月被美國食品和藥物管理局批準用于晚期GIST的治療[30]。伊馬替尼能選擇性抑制靶向突變基因的表達，對80%的GIST患者具有確切療效。但隨著伊馬替尼的臨床應(yīng)用，大量研究表明，約15%的GIST患者在治療初期即存在原發(fā)性耐藥，50%以上的患者隨著治療時間的延長陸續(xù)出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥，耐藥機制可能與基因擴增、二次突變、信號傳導(dǎo)通路異常激活或體內(nèi)藥物濃度改變有關(guān)[31]。目前，伊馬替尼的耐藥性問題已成為GIST靶向治療中最迫切需要解決的問題之一。針對這一問題，目前的應(yīng)對方案主要有兩種，即增加伊馬替尼用量或替換二線、三線用藥，例如美國食品和藥物管理局已批準舒尼替尼二線及瑞格替尼三線的治療方式。但增加伊馬替尼的用量無疑會帶來更大的藥物副作用，且舒尼替尼及瑞格替尼也會迅速出現(xiàn)耐藥反應(yīng)，兩種藥物的腫瘤進展中位時間分別為27.3周[32]和20.8周[33]，療效十分有限。更多更新的分子靶向治療藥物仍在探索中。

3 對伊馬替尼耐藥的GIST以及JAK2的潛在應(yīng)用價值

3.1 原發(fā)性伊馬替尼耐藥 盡管目前伊馬替尼是治療轉(zhuǎn)移性或高風險GIST的主要藥物，但有少部分亞組患者(15%)在治療初期即表現(xiàn)出對伊馬替尼的原發(fā)性耐藥。(1)琥珀酸脫氫酶基因突變亞型GIST患者，不存在KIT和PDGFRα基因突變，被歸類為WT-GIST，該類型GIST在兒童中常見，在成年人中偶見。Boikos等[34]發(fā)現(xiàn)，49例使用伊馬替尼治療的WT-GIST患者中僅有1例對伊馬替尼敏感。(2)另一類常見原發(fā)性伊馬替尼耐藥的患者中僅存在PDGFRα基因突變(占5%～7%)，PDGFR基因第18外顯子中含D842的密碼子替換可能引起伊馬替尼耐藥，其原因是PDGFR基因外顯子D842V的突變導(dǎo)致激酶激活環(huán)發(fā)生畸變，從而使蛋白質(zhì)構(gòu)象強烈傾斜，有利于激活結(jié)構(gòu)；而第18外顯子(D846Y、N848K、Y849K和HDSN845-848p)的其他突變均表現(xiàn)為對伊馬替尼敏感[35-36]。Cassier 等[37]對58例PDGFRα基因突變的GIST患者進行了研究，發(fā)現(xiàn)其中32例患者存在PDGFRα第18外顯子D842V突變，17例發(fā)生第18外顯子其他密碼子的突變；剩下的9例則為其他外顯子突變，在31例可評估的D842V突變病例中無一例對伊馬替尼敏感；D842V突變者中位無進展生存期為2.8個月，其他突變者中位無進展生存期為28.5個月。(3)而在KIT基因突變的GIST患者中，不同位點的突變似乎也存在著藥物敏感性的差異。例如，相較于第9外顯子突變，第11外顯子突變的GIST患者對伊馬替尼治療(400 mg/d)更敏感，但增加伊馬替尼藥物濃度(800 mg/d)可提高第9外顯子突變患者的治療效果，其原因可能與基因擴增或受體數(shù)量有關(guān)[38]。據(jù)此推測，原發(fā)性伊馬替尼耐藥的原因主要與有無KIT/PDGFRα突變、KIT基因突變類型和PDGFRα-D842V突變有關(guān)。

3.2 繼發(fā)性伊馬替尼耐藥 有學(xué)者對耐藥GIST患者的KIT基因分析，發(fā)現(xiàn)常見的繼發(fā)性耐藥基因突變位點為第17、13和14外顯子，這些位點通常為三磷酸腺苷的結(jié)合位點和激活環(huán)，以點突變形式居多，認為繼發(fā)性伊馬替尼耐藥與KIT/PDGFR基因的二次突變有關(guān)[39]。Kang等[40]對繼發(fā)性伊馬替尼耐藥患者進行基因型檢測，在WT-GIST患者中尚未發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性KIT/PDGFR突變，存在原發(fā)性第11外顯子突變的患者較第9外顯子突變患者具有更強繼發(fā)性突變的傾向。這有可能與GIST患者的用藥時間有關(guān)，提示繼發(fā)性突變的概率會隨著伊馬替尼治療時間的延長而增加，突變原因可能是長期伊馬替尼治療導(dǎo)致的選擇性耐藥腫瘤的克隆。

雖然KIT/PDGFR基因的二次突變解釋了部分繼發(fā)性伊馬替尼耐藥原因，但仍有部分GIST患者未檢測到KIT/PDGFR基因的二次突變。有學(xué)者認為，繼發(fā)性耐藥與腫瘤激活其他酪氨酸激酶或擴增KIT/PDGFR基因等未知的分子機制有關(guān)，在經(jīng)干細胞因子刺激后，正常活化的c-KIT可激活JAK/STAT通路、PI3K/Akt等下游通路，起到誘導(dǎo)細胞增殖的作用[41]。而GIST中是否有與干細胞因子無關(guān)的KIT激活特有的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，目前尚未明確。

3.3 JAK2在伊馬替尼耐藥GIST中的潛在應(yīng)用價值 伊馬替尼等酪氨酸激酶抑制劑的應(yīng)用顯著改善了GIST患者的預(yù)后。關(guān)于JAK2耐藥性的研究除上文所述的實體瘤外，JAK2耐藥性在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究也在不斷深入[42]。而目前關(guān)于JAK2是否參與了伊馬替尼耐藥GIST的研究仍較少。各個通路在伊馬替尼耐藥發(fā)生機制中可能并不單獨存在，當然也不排除伊馬替尼藥物濃度在血液中的變化引起伊馬替尼耐藥，比如老年人某些藥物可影響伊馬替尼在血液中的濃度，體表面積較大者或胃大部分切除術(shù)的患者，長期服用伊馬替尼后血藥濃度下降，使得GIST細胞重新激活，也可能促使了GIST細胞的增殖和耐藥。Paner等[43]對11例GIST患者的腫瘤組織進行了免疫組織化學(xué)檢測后發(fā)現(xiàn)，所有GIST細胞質(zhì)中磷酸化STAT3(Tyr705)表達均較高；隨后他們使用AG490抑制JAK2通路，發(fā)現(xiàn)經(jīng)AG490處理后的原代GIST細胞的B細胞淋巴瘤-2基因表達下調(diào)，這表明STAT3在GIST中處于異常激活狀態(tài)，抑制JAK2的表達能夠抑制腫瘤生長并誘導(dǎo)凋亡，提示JAK2/STAT3信號通路參與GIST細胞的存活；而在采用伊馬替尼治療后， GIST細胞質(zhì)中磷酸化STAT3濃度上升，提示可能存在其他激活JAK2/STAT3信號通路的途徑。因此，研究JAK2在GIST中的作用可能成為治療伊馬替尼耐藥GIST患者的新突破點，為解決伊馬替尼耐藥性提供新的思路。

4 小 結(jié)

因很少在實體腫瘤中檢測到JAK2突變，既往認為其主要參與的是血液系統(tǒng)腫瘤等相關(guān)疾病。但在實體腫瘤中，JAK2可通過多種通路的異常激活致使細胞增殖失控，從而促進細胞惡性轉(zhuǎn)化，其與人類多種惡性腫瘤的產(chǎn)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)，研究該蛋白的作用機制有利于有效治療腫瘤。

雖然目前對JAK2在GIST的發(fā)生、發(fā)展乃至藥物敏感性中的作用機制研究還處于初步階段，但在其他實體/非實體惡性腫瘤中已發(fā)現(xiàn)JAK2通過各種途徑的異常激活導(dǎo)致腫瘤對分子靶向藥物產(chǎn)生耐藥性，而在GIST中，細胞質(zhì)中JAK2的表達在使用伊馬替尼后明顯增高，不排除存在不依賴KIT基因激活的JAK2/STAT3信號通路途徑，故推測JAK2在GIST伊馬替尼耐藥中具有潛在研究價值，了解JAK2在GIST中的作用將為GIST患者提供更好的治療思路及方案。