馮貞,崔宇宏,李民生,連云嵐,周瑞雪,郝云芳,魏鋒
1.山西省食品藥品檢驗(yàn)所,山西 太原 030001;2.中國(guó)食品藥品檢定研究院 中藥民族藥檢定所,北京 100050
隨著藥材野生資源的匱乏,栽培品將是未來(lái)中藥的主要來(lái)源,但在種植過(guò)程中,往往存在未真正了解植物的生長(zhǎng)習(xí)性而盲目引種或非道地產(chǎn)區(qū)種植、種植方法不規(guī)范、重產(chǎn)量而輕質(zhì)量等問(wèn)題,導(dǎo)致中藥材及飲片整體質(zhì)量下降較為嚴(yán)重。如何科學(xué)、合理地評(píng)價(jià)栽培藥材的質(zhì)量,更好地引導(dǎo)種植,使種植的藥材質(zhì)量接近于野生,是藥材評(píng)價(jià)的主要目的之一。
防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根,春、秋二季采挖未抽花莖植株的根,除去須根和泥沙,曬干[1]。防風(fēng)飲片為山西省食品藥品檢驗(yàn)所2019 年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種,通過(guò)市場(chǎng)調(diào)研、標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)及探索性研究,發(fā)現(xiàn)防風(fēng)藥材在野生變家種過(guò)程中,存在的主要問(wèn)題為非適宜區(qū)種植、栽培年限短而導(dǎo)致性狀變異較大、質(zhì)量下降的問(wèn)題。因此,科學(xué)、合理地評(píng)價(jià)栽培藥材的質(zhì)量除了依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)規(guī)定的檢測(cè)手段以外,更重要的是對(duì)藥材質(zhì)量形成的背景和因素進(jìn)行全面調(diào)研考察。從藥材資源評(píng)估,藥材市場(chǎng)流通情況調(diào)研,野生和栽培方式、產(chǎn)地調(diào)研,地方習(xí)用品調(diào)研,對(duì)野生與栽培藥材的質(zhì)量及現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)存在的問(wèn)題進(jìn)行全方位的考察與分析。尤其應(yīng)注重產(chǎn)地調(diào)研,比較不同種植區(qū)域、不同生長(zhǎng)年限、不同播種方式對(duì)藥材質(zhì)量的影響,考察栽培品化學(xué)成分積累與野生品的差異,以評(píng)價(jià)是否真正可以用家種代替野生,并制定具備合理性和科學(xué)性的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此,本研究以防風(fēng)為例,探討中藥材及飲片質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究思路。
20 世紀(jì)70 年代以前,防風(fēng)藥材主要來(lái)源于野生資源,廣泛分布于我國(guó)北方平原及半山區(qū)地帶,主要分布于吉林、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、山東、河北、河南、陜西、山西、甘肅等地。由于產(chǎn)地不同,產(chǎn)于河北的防風(fēng)習(xí)稱“口防風(fēng)”或“西防風(fēng)”;產(chǎn)于內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江的防風(fēng)習(xí)稱“關(guān)防風(fēng)”,關(guān)防風(fēng)是防風(fēng)類藥材中的上品,質(zhì)量最佳。隨著多年的采挖,防風(fēng)野生資源緊缺,逐漸難以滿足市場(chǎng)需求,早在1987 年,我國(guó)《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種名錄》就將防風(fēng)藥材的原植物列為國(guó)家三級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物。目前市場(chǎng)上野生品主要來(lái)源于我國(guó)內(nèi)蒙古海拉爾,其次是俄羅斯、蒙古國(guó)及中國(guó)東北,野生品僅占防風(fēng)市場(chǎng)份額的5%~10%。
20 世紀(jì)70 年代后,防風(fēng)開始人工引種馴化,自21 世紀(jì)初開始大面積栽培以來(lái),種植區(qū)域更加廣泛,栽培防風(fēng)已成為市場(chǎng)的主體。目前家種防風(fēng)的兩大主要產(chǎn)區(qū)為河北和內(nèi)蒙古。河北的主產(chǎn)區(qū)在石家莊市行唐縣及保定市安國(guó)市;內(nèi)蒙古的主產(chǎn)區(qū)為赤峰牛營(yíng)子地區(qū)。另黑龍江、甘肅、山西、河南、安徽、遼寧等地也有部分地區(qū)種植,但供應(yīng)量不大。栽培品市場(chǎng)份額達(dá)到90%以上。
防風(fēng)的地方習(xí)用品種較多,按地區(qū)習(xí)用又分為水防風(fēng)(寬萼巖風(fēng))、陜防風(fēng)(華山前胡)、川防風(fēng)、云防風(fēng)(竹葉防風(fēng))、西北小防風(fēng)(葛縷子、田葛縷子等)、石防風(fēng)、絨果芹等。經(jīng)過(guò)調(diào)研,市場(chǎng)上防風(fēng)的易混品主要為水防風(fēng),為傘形科巖風(fēng)屬植物寬萼巖風(fēng)Libonotis laticalycinaShan et sheh 的干燥根,又稱河南水防風(fēng),是河南省的防風(fēng)習(xí)用品種,主產(chǎn)于河南鄭州市、滎陽(yáng)市汜水鎮(zhèn),山西運(yùn)城地區(qū)的芮城、解州、絳縣、臨汾等地區(qū),又稱“河南小防風(fēng)”“小防風(fēng)”“汜水防風(fēng)”等,收載于《河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1991年版[2-3]。
本課題組通過(guò)對(duì)安徽亳州、河北安國(guó)等國(guó)內(nèi)大型中藥材專業(yè)市場(chǎng)進(jìn)行調(diào)研,了解防風(fēng)藥材資源的野生與栽培情況。調(diào)研結(jié)果表明,防風(fēng)栽培品主產(chǎn)區(qū)為河北保定地區(qū)、內(nèi)蒙古赤峰地區(qū);次產(chǎn)區(qū)為黑龍江大慶、內(nèi)蒙古呼倫貝爾、甘肅定西、山西運(yùn)城、安徽亳州、遼寧沈陽(yáng)等地區(qū)。防風(fēng)栽培方式有籽播、秧播2 種。籽播又稱種子直播,分為1 年生及多年生。1 年生防風(fēng)主產(chǎn)區(qū)為內(nèi)蒙古赤峰、河北安國(guó),市場(chǎng)占有率大;籽播多年生防風(fēng)多為2~3 年,主產(chǎn)區(qū)為黑龍江大慶、內(nèi)蒙古呼倫貝爾,但市場(chǎng)占有率小。秧播為整根移栽及根段繁殖2 種方式。整根移栽方式為第一年育苗,第二年移栽。即挖取1 年生防風(fēng)幼苗,采取平栽和斜栽法,甘肅定西地區(qū)為此類種植模式。根段繁殖又稱分根繁殖,在秋季或早春收獲籽播1年的苗,去掉根頭部分(蘆),截成3~5 cm 小段作為插條來(lái)栽種,主產(chǎn)區(qū)為河北安國(guó)、行唐地區(qū)及安徽亳州等地。采用秧播繁殖的防風(fēng)生長(zhǎng)速度較快、直徑粗、產(chǎn)量大、市場(chǎng)占有率較高。
通過(guò)調(diào)研藥材市場(chǎng)及種植產(chǎn)區(qū),共收集74 份防風(fēng)藥材樣品,其中野生品24 份,籽播1 年生樣品19份,籽播多年生樣品14份(多為2~3年,個(gè)別4年)、秧播樣品17 份,見表1。2019 年,國(guó)家評(píng)價(jià)性抽檢防風(fēng)飲片236 批次,其中86 批野生品、120 批籽播栽培品、30 批秧播品。在以《中國(guó)藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)收載的項(xiàng)目為指標(biāo)的基礎(chǔ)上,增加香豆素類薄層色譜鑒別、高效液相色譜法(HPLC)指紋圖譜、揮發(fā)油含量等項(xiàng)目,比較防風(fēng)栽培品與野生品質(zhì)量差異。
表1 調(diào)研收集防風(fēng)藥材信息
野生防風(fēng)的主要特征為“直根、蚯蚓頭、菊花心、裂隙”。籽播1 年栽培品無(wú)野生防風(fēng)蚯蚓頭特征;籽播2~3 年生栽培品部分出現(xiàn)蚯蚓頭特征,性狀逐漸接近于野生。秧播品直徑粗、無(wú)蚯蚓頭特征,尤其分根繁殖性狀變異較大,母根短而膨大,支根多,與傳統(tǒng)外觀性狀差異較大,多不被市場(chǎng)認(rèn)可。整體來(lái)說(shuō),栽培防風(fēng)的表面顏色較野生防風(fēng)淺,根頭部的蚯蚓頭不明顯或無(wú),體重,質(zhì)硬,斷面平坦,裂隙不明顯,味較野生防風(fēng)甜。
防風(fēng)野生品皮層裂隙明顯,油管多見;栽培品皮層裂隙少或不明顯、油管少見。防風(fēng)化學(xué)成分有色原酮、香豆素、揮發(fā)油、多糖、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)元素、聚乙炔等類化合物,主要化學(xué)成分是色原酮類成分,有亥茅酚苷、升麻素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚、乙酰亥茅酚、當(dāng)歸酰亥茅酚等。此外,還有香豆素類成分,如補(bǔ)骨酯素、香柑內(nèi)酯、歐前胡素、異歐前胡素、紫花前胡苷元等[4-5]。對(duì)防風(fēng)及水防風(fēng)色原酮類成分、揮發(fā)性成分及香豆素類成分進(jìn)行薄層色譜差異性分析,同時(shí)也分析野生、栽培藥材的差異性?!吨袊?guó)藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)的是色原酮類成分。由于防風(fēng)與水防風(fēng)(寬萼巖風(fēng))含有相似的色原酮類及揮發(fā)性成分,無(wú)法區(qū)分,專屬性不強(qiáng)。而且野生品與栽培品色譜也無(wú)明顯差異。
針對(duì)色原酮類成分及揮發(fā)性成分無(wú)法區(qū)分防風(fēng)與水防風(fēng)的性狀,建立了香豆素類成分薄層鑒別方法,以正己烷-乙酸乙酯(8∶3.5)為展開劑,噴10%氫氧化鉀甲醇溶液,紫外(UV)365 nm 下檢視。結(jié)果表明,防風(fēng)與水防風(fēng)所含香豆素類成分薄層鑒別差異明顯,能有效區(qū)分防風(fēng)及水防風(fēng),又能作為防風(fēng)中摻入水防風(fēng)的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法,解決防風(fēng)摻混水防風(fēng)的現(xiàn)象(圖1)。對(duì)野生品及栽培品的薄層色譜斑點(diǎn)進(jìn)行比較,結(jié)果表明,籽播多年生色譜斑點(diǎn)與野生品、對(duì)照藥材基本一致。籽播1年生、秧播品多缺失上部1個(gè)藍(lán)色熒光斑點(diǎn)或此斑點(diǎn)較弱(圖2)。
圖1 防風(fēng)與水防風(fēng)薄層色譜
圖2 野生、栽培防風(fēng)樣品薄層色譜
采用《中國(guó)藥典》2020 年版一部防風(fēng)項(xiàng)下的浸出物測(cè)定方法,對(duì)236 批防風(fēng)飲片的醇溶性浸出物進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,栽培品的醇溶性浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于野生品(圖3)。
圖3 野生、栽培防風(fēng)樣品中醇溶性浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)
按照《中國(guó)藥典》2020 年版一部通則0512 的HPLC 同時(shí)測(cè)定調(diào)研收集防風(fēng)藥材(14 份野生品、19 份籽播1 年生、10 份籽播多年生及14 份秧播栽培品)及抽檢飲片236 批(野生品86 批、籽播120 批、秧播30 批)中升麻素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷4 個(gè)色原酮類成分的含量。比較不同栽培方式、不同生長(zhǎng)年限與野生品含量差異,評(píng)價(jià)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)與限度的合理性。結(jié)果表明,無(wú)論是4 個(gè)色原酮類化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)還是《中國(guó)藥典》2020 年版規(guī)定的升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷2 個(gè)成分的總質(zhì)量分?jǐn)?shù),均為野生品>籽播多年生>秧播>籽播1 年生(圖4),野生防風(fēng)明顯高于栽培防風(fēng),其中籽播多年生栽培品含量更接近于野生防風(fēng),籽播1年生與秧播含量明顯低于野生品。236批防風(fēng)飲片中,86 批野生品中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷2 個(gè)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為0.73%,籽播升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷2 個(gè)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為0.44%,秧播升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷2個(gè)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為0.31%。《中國(guó)藥典》2020 年版規(guī)定升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷2個(gè)成分總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于0.24%,遠(yuǎn)低于測(cè)定值的平均水平,需提高含量限度。
圖4 栽培、野生防風(fēng)樣品中色原酮類化合物含量比較
對(duì)調(diào)研收集防風(fēng)藥材按《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則進(jìn)行揮發(fā)油測(cè)定。結(jié)果表明,10 批防風(fēng)野生品中揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%,9 批籽播多年生為0.15%,1年生籽播與秧播為0.1%。野生品>籽播多年生>籽播1 年≈秧播,栽培品中揮發(fā)油含量明顯小于野生品。
采用甲醇回流提取,制備供試品溶液,色譜條件為梯度洗脫,二極管整列(DAD)檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,建立HPLC 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的方法,用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”2.0版進(jìn)行評(píng)價(jià),野生品相似度>0.90、栽培品相似度<0.90,進(jìn)行比較,排序?yàn)橐吧罚咀巡テ罚狙聿ィ▓D5),栽培品相似度低于野生品。
圖5 野生、栽培防風(fēng)樣品指紋圖譜相似度比較
對(duì)調(diào)研樣品、抽驗(yàn)樣品、道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)飲片在性狀、薄層色譜、色原酮類成分的含量、HPLC 指紋圖譜多個(gè)方面綜合進(jìn)行質(zhì)量分析。結(jié)果表明,栽培防風(fēng)與野生防風(fēng)相比均存在差異。
性狀仍是中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的重點(diǎn),野生防風(fēng)的蚯蚓頭特征是防風(fēng)多年生的標(biāo)志,栽培品栽培年限較短,多為1年生,而野生品可達(dá)到3~4年,甚至5年以上;故多缺失“蚯蚓頭”的性狀特點(diǎn)。野生防風(fēng)明顯的“菊花心”是防風(fēng)根積累較少糖類的結(jié)果,也是旱生環(huán)境和多年累積所致,總體表現(xiàn)的是一種逆境生長(zhǎng)環(huán)境。家種品外表面類白色或淺棕色,而非灰棕色或棕褐色,細(xì)嫩而非粗糙,質(zhì)地堅(jiān)實(shí),切面無(wú)裂隙,味甜,與家種大水、大肥、營(yíng)養(yǎng)較好有關(guān)?!绑w輕、質(zhì)松、有裂隙”也成為高成分含量的形態(tài)特征(表2)。因此,《中國(guó)藥典》2020 年版防風(fēng)質(zhì)量的性狀評(píng)價(jià)方法可較好地評(píng)價(jià)野生防風(fēng)藥材的質(zhì)量[6-7]。野生品在皮部的油管數(shù)量多于栽培品,與其揮發(fā)油成分積累高于栽培品有關(guān)。栽培品色原酮類成分含量明顯低于野生品,與其生長(zhǎng)年限明顯低于野生品有關(guān),說(shuō)明《中國(guó)藥典》2020 年版的含量測(cè)定指標(biāo)是合理的,其含量高低可以作為評(píng)價(jià)藥材及其飲片質(zhì)量?jī)?yōu)劣的指標(biāo)。而栽培品的浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值明顯高于野生品,可能與其含有的淀粉、糖類物質(zhì)高有關(guān),可見浸出物量的高低不能反映藥材品質(zhì)的優(yōu)劣。
表2 調(diào)研防風(fēng)樣品(野生品、栽培品)各指標(biāo)比較
藥材品質(zhì)的優(yōu)劣與其道地性和區(qū)域性密不可分,通過(guò)比較道地產(chǎn)區(qū)(內(nèi)蒙古、黑龍江、遼寧、吉林)與非道地產(chǎn)區(qū)(河北、安徽、甘肅、山東、山西、陜西)栽培防風(fēng)飲片的香豆素類薄層鑒別、4 種色原酮類成分含量總和及HPLC 指紋圖譜,道地產(chǎn)區(qū)的各項(xiàng)指標(biāo)均明顯高于非道地產(chǎn)區(qū)(表3)。
表3 道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)防風(fēng)栽培品(飲片)各指標(biāo)比較
道地產(chǎn)區(qū)的種植方式多為籽播,與野生繁殖方式基本一致;天氣涼爽,無(wú)霜期短,種植年限可以達(dá)到2~3 年。為了保證藥品質(zhì)量,盡量在符合原產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境的地方進(jìn)行引種,保證藥材的道地性。藥材的有效成分通常是植物的次生代謝成分,逆境可提高次生代謝產(chǎn)物的含量,促進(jìn)道地藥材質(zhì)量的形成。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)及探索性研究,發(fā)現(xiàn)《中國(guó)藥典》2020 年版中防風(fēng)質(zhì)量評(píng)價(jià)有待提高完善。1)《中國(guó)藥典》2020 年版標(biāo)準(zhǔn)描述防風(fēng)藥材及飲片的性狀均為野生品性狀,未收載栽培防風(fēng),給中藥材和中藥飲片的鑒定和檢驗(yàn)工作造成了一些困惑,應(yīng)將栽培防風(fēng)性狀收入標(biāo)準(zhǔn)。2)在探索性研究中發(fā)現(xiàn),防風(fēng)及其易混品水防風(fēng)藥材性狀相近,飲片混入后更是難以鑒別,現(xiàn)行薄層色譜條件檢測(cè)的是色原酮類成分,兩者有相同的色原酮類成分,故無(wú)法區(qū)分,應(yīng)增加香豆素的薄層色譜鑒別方法。3)236 批飲片升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷2 個(gè)成分平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.53%,而《中國(guó)藥典》2020 年版限度為0.24%,遠(yuǎn)低于平均水平,無(wú)法有效控制飲片的質(zhì)量,需適當(dāng)提高含量限度。
在各種植區(qū)域內(nèi),不同產(chǎn)地防風(fēng)的種植方式不盡相同,包括直播、移栽、根段營(yíng)養(yǎng)繁殖等。秧播種植方式導(dǎo)致防風(fēng)性狀變異,尤其根段繁殖方式性狀變異較大,多不被市場(chǎng)認(rèn)可。另外栽培品防風(fēng)種植年限均較短,多為1年,少數(shù)為2~3年,導(dǎo)致生物活性成分積累明顯低于野生品,呈質(zhì)量下降的趨勢(shì)。
追求質(zhì)量才是栽培生產(chǎn)的終極目標(biāo),中藥材栽培發(fā)展的指導(dǎo)原則應(yīng)該是在優(yōu)質(zhì)基礎(chǔ)上高產(chǎn)。通過(guò)從性狀、鑒別、成分含量等多方面進(jìn)行比較,籽播多年生防風(fēng)樣品更接近于野生品,東北、內(nèi)蒙古道地產(chǎn)區(qū)栽培品質(zhì)量?jī)?yōu)于非道地產(chǎn)區(qū)。為了保證臨床療效,建議防風(fēng)栽培方式應(yīng)是籽播方式,在東北、內(nèi)蒙古道地產(chǎn)區(qū),種植2 年以上,以使其品質(zhì)接近于野生品。應(yīng)避免盲目跟風(fēng)種植、粗放式種植及不規(guī)范化種植,防范種質(zhì)退化,提高藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性。
應(yīng)將栽培品納入《中國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),以符合防風(fēng)的市場(chǎng)現(xiàn)狀。參考《四川地方藥材標(biāo)準(zhǔn)》1987 年版中防風(fēng)(引種防風(fēng)),并結(jié)合本次評(píng)價(jià)結(jié)果,規(guī)定栽培品來(lái)源為傘形科植物防風(fēng)S.divaricata(Turcz.)Schischk.的種子經(jīng)直播栽培的干燥根。春、秋兩季采挖播種后2~3 年的未抽花莖植株的根,除去須根和泥沙,曬干。其中“直播栽培”及“采挖播種后2~3 年的根”是栽培防風(fēng)的關(guān)鍵,這樣栽培出的防風(fēng)才能更接近于野生。增加香豆素類成分的薄層色譜鑒別方法,除了控制生長(zhǎng)年限外,還能控制防風(fēng)摻偽的現(xiàn)象。提高色原酮類成分的含量限度,以控制一些不規(guī)范種植方式和產(chǎn)地南移問(wèn)題,保證防風(fēng)藥材及飲片的質(zhì)量。
充分調(diào)研考察是評(píng)價(jià)的前提與關(guān)鍵。應(yīng)了解栽培的道地產(chǎn)區(qū)、主產(chǎn)區(qū)、次產(chǎn)區(qū)的原藥材栽培方式、種植年限,廣泛收集不同產(chǎn)區(qū)具有代表性的樣品。應(yīng)以野生品為標(biāo)桿,比較栽培品與野生品、道地產(chǎn)區(qū)與非道地產(chǎn)區(qū)藥材在性狀、鑒別、指紋圖譜、浸出物含量、生物活性成分含量等多方面的差異,并分析引起差異的原因,引導(dǎo)正確的栽培模式,使得栽培品的各項(xiàng)指標(biāo)更接近于野生品,再根據(jù)研究結(jié)果制定合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。