歐前胡素下調(diào)MCL-1提高口腔鱗癌干細(xì)胞順鉑敏感性實(shí)驗(yàn)研究

徐旭

歐前胡素下調(diào)MCL-1提高口腔鱗癌干細(xì)胞順鉑敏感性實(shí)驗(yàn)研究

徐旭

目的探討中藥白芷活性成分歐前胡素增強(qiáng)順鉑對(duì)口腔鱗癌干細(xì)胞的殺傷活性及其機(jī)制。方法流式細(xì)胞術(shù)檢測歐前胡素和順鉑對(duì)Cal27細(xì)胞系的腫瘤干細(xì)胞種群比例的影響。MTT法和Annexin V染色法檢測歐前胡素對(duì)順鉑殺傷Cal27腫瘤干細(xì)胞能力的影響。利用Western blot方法驗(yàn)證歐前胡素是否調(diào)節(jié)Cal27腫瘤干細(xì)胞MCL-1的表達(dá)。運(yùn)用JC-1染色、Annexin V染色及Western blot方法研究歐前胡素影響順鉑療效的信號(hào)通路。結(jié)果順鉑組Cal27細(xì)胞系的腫瘤干細(xì)胞種群比例顯著高于對(duì)照組（19.4%比8.5%，P＜0.05），而順鉑聯(lián)合歐前胡素組后腫瘤干細(xì)胞種群比例下降至11.5%（P＜0.05）。順鉑聯(lián)合歐前胡素組對(duì)Cal27腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞活力的抑制率為（57.4± 3.4）%，凋亡誘導(dǎo)率為（36.7±2.1）%，均顯著高于歐前胡素組的（7.9±6.6）%與（4.2±0.4）%（P＜0.05）和順鉑組的（11.8±0.8）%與（8.4±0.5）%（P＜0.05）。順鉑聯(lián)合歐前胡素組Cal27腫瘤干細(xì)胞的線粒體膜電位顯著低于歐前胡素組和順鉑組（0.37±0.02比0.96±0.04、0.86±0.03，P＜0.05）。順鉑聯(lián)合歐前胡素組處理的Cal27腫瘤干細(xì)胞的caspase-9和caspase-3的活化水平分別為0.48±0.03、0.56±0.04，顯著高于歐前胡素組的0.03±0.01（P＜0.05）、0.03±0.01（P＜0.05）和順鉑組的0.10±0.02（P＜0.05）、0.12± 0.02（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，歐前胡素處理后Cal27腫瘤干細(xì)胞的MCL-1表達(dá)水平顯著降低（0.29±0.02比0.89±0.05，P＜0.05），而順鉑對(duì)MCL-1的表達(dá)無影響（0.90±0.05比0.89±0.05，P＞0.05）。結(jié)論歐前胡素可通過下調(diào)MCL-1的表達(dá)提高口腔鱗癌干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

口腔鱗癌干細(xì)胞；MCL-1；歐前胡素；順鉑；線粒體；凋亡

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中一小群具有高度致瘤性的細(xì)胞，它們具有干細(xì)胞樣的特征，能快速自我更新，導(dǎo)致腫瘤的術(shù)后復(fù)發(fā)且對(duì)化療有較強(qiáng)的抵抗性[1-2]?？谇击[癌是危害人類健康的常見腫瘤之一，盡管現(xiàn)在治療手段有了很大的進(jìn)步，但該病預(yù)后仍不十分理想，患者的五年存活率仍很低[3]，對(duì)于不能進(jìn)行手術(shù)的患者，化療是重要的治療手段，因此提高腫瘤細(xì)胞尤其是腫瘤干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性有十分重要的意義。本文目的在于研究歐前胡素是否能增強(qiáng)順鉑對(duì)口腔鱗癌干細(xì)胞的殺傷活性并研究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 噻唑藍(lán)（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、歐前胡素、順鉑、Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒（美國 Sigma-Aldrich）。細(xì)胞蛋白提取液、髓細(xì)胞白血病基因1 （MCL-1）抗體、活化型半胱天冬酶-9（cleaved caspase-9）抗體、活化型半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）抗體和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（美國Cell Signaling）。JC-1染料（江蘇碧云天生物科技有限公司）。CD44流式抗體 （美國 SantaCruz）。脂質(zhì)體 2000 （Lipofectamine 2000）（美國Invitrogen）。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（ECL）試劑盒（美國Pierce）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人口腔鱗癌細(xì)胞系Cal27購于美國美國模式菌種收集中心（ATCC）。Cal27腫瘤干細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，CD44陽性的Cal27細(xì)胞即為Cal27腫瘤干細(xì)胞[4]。所有腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 將MCL-1基因cDNA全長序列（Gene ID：NM_001197320）以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成MCL-1重組真核表達(dá)質(zhì)粒[5]。使用Lipofectamine 2000按照試劑操作說明書步驟將2μg/mL MCL-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Cal27腫瘤干細(xì)胞中。

1.4 Cal27腫瘤干細(xì)胞所占比例測定 將Cal27細(xì)胞按1×106/孔接種在6孔板上，分為對(duì)照組、歐前胡素組、順鉑組、順鉑+歐前胡素組并按文獻(xiàn)所述進(jìn)行處理[6]。對(duì)照組為Cal27細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組在Cal27細(xì)胞中加入5μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，歐前胡素組在Cal27細(xì)胞中加入10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素組在Cal27細(xì)胞中加入5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌兩次，加入CD44抗體在暗處孵育20min后將細(xì)胞用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，計(jì)算CD44陽性的Cal27細(xì)胞所占總的Cal27細(xì)胞的比例。

1.5 細(xì)胞活力檢測 Cal27腫瘤干細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上，分為對(duì)照組、歐前胡素組、順鉑組、順鉑+歐前胡素組和順鉑+歐前胡素+MCL-1質(zhì)粒組。對(duì)照組為Cal27腫瘤干細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組在Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入5μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，歐前胡素組在Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素組在 Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入 5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素+ MCL-1質(zhì)粒組先將 2μg/mL的 MCL-1質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入Cal27腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)24h，之后更換培養(yǎng)基再加入5μmol/L的順鉑和10 μmol/L的歐前胡素繼續(xù)培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后在培養(yǎng)體系中加入20μL 5g/L MTT再培養(yǎng)4h，棄去上清，往孔中加入150μL二甲亞砜，在570nm波長下用酶標(biāo)儀檢測OD值，細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組-OD治療組）/OD對(duì)照組×100%。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) Cal27腫瘤干細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，分為對(duì)照組、歐前胡素組，順鉑組、順鉑+歐前胡素組和順鉑+歐前胡素+MCL-1質(zhì)粒組。對(duì)照組為Cal27腫瘤干細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組在Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入5μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，歐前胡素組在Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素組在Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入5μmol/L順鉑和10μmol/L歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素+MCL-1質(zhì)粒組先將2μg/mL的MCL-1質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入Cal27腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)24h，之后更換培養(yǎng)基再加入5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素繼續(xù)培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌兩次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比表示。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 將Cal27腫瘤干細(xì)胞按2× 106/孔接種在6孔板上，分為對(duì)照組、歐前胡素組、順鉑組、順鉑+歐前胡素組和順鉑+歐前胡素+MCL-1質(zhì)粒組。對(duì)照組為Cal27腫瘤干細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組在Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入5μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，歐前胡素組在Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素組在 Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入 5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素+ MCL-1質(zhì)粒組先將2μg/mL的MCL-1質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入Cal27腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)24h，之后更換培養(yǎng)基再加入5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素繼續(xù)培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌兩遍并提取總蛋白質(zhì)。將蛋白提取液用12.5%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用 MCL-1抗體、cleaved caspase-9抗體、cleaved caspase-3抗體或β-actin抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。蛋白灰度值分析用Image J軟件處理。目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平用其蛋白灰度值與βactin灰度值的比值表示。

1.8 線粒體膜電位測定 線粒體膜電位用JC-1染色進(jìn)行測定[7]。將Cal27腫瘤干細(xì)胞按2×106/孔接種在6孔板上，分為對(duì)照組、歐前胡素組、順鉑組、順鉑+歐前胡素組。對(duì)照組為Cal27腫瘤干細(xì)胞不加藥物培養(yǎng)48h，順鉑組在Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入5μmol/L的順鉑培養(yǎng)48h，歐前胡素組在Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h，順鉑+歐前胡素組在Cal27腫瘤干細(xì)胞中加入5μmol/L的順鉑和10μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48h。藥物處理完畢后將細(xì)胞用生理鹽水洗滌兩遍，加入JC-1染料在暗處孵育20min，再用生理鹽水洗滌兩遍后用流式細(xì)胞儀檢測JC-1的熒光強(qiáng)度。治療組的相對(duì)線粒體膜電位為各治療組的JC-1熒光強(qiáng)度與對(duì)照組熒光強(qiáng)度的比值。

2 結(jié)果

2.1 歐前胡素顯著提高順鉑對(duì)Cal27腫瘤干細(xì)胞的殺傷活性 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，順鉑單獨(dú)治療可提高Cal27細(xì)胞系中的腫瘤干細(xì)胞種群比例，而聯(lián)用歐前胡素后，Cal27腫瘤干細(xì)胞的比例受到抑制而顯著下降（P＜0.05），見表1。細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)和凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聯(lián)用歐前胡素后，順鉑對(duì)Cal27腫瘤干細(xì)胞的殺傷活性顯著增強(qiáng)，見表2。

表1 歐前胡素減弱順鉑對(duì)Cal27腫瘤干細(xì)胞種群比例的影響（±s）

表1 歐前胡素減弱順鉑對(duì)Cal27腫瘤干細(xì)胞種群比例的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與順鉑+歐前胡素組比較，#P＜0.05

表2 歐前胡素顯著提高順鉑對(duì)Cal27腫瘤干細(xì)胞的抗腫瘤活性（±s）

表2 歐前胡素顯著提高順鉑對(duì)Cal27腫瘤干細(xì)胞的抗腫瘤活性（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與順鉑+歐前胡素組比較，#P＜0.05

組別對(duì)照組順鉑組歐前胡素組順鉑+歐前胡素組孔數(shù) 順鉑（μmol/L）歐前胡素（μmol/L）3 3 3 3 0 5 0 5 0 0 1 0 10細(xì)胞活力抑制率（%）0 11.8±0.8*#7.9±0.6*#57.4±3.4凋亡誘導(dǎo)率（%）2.1±0.3 8.4±0.5*#4.2±0.4*#36.7±2.1*

2.2 歐前胡素通過線粒體途徑提高Cal27腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，歐前胡素能顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)Cal27腫瘤干細(xì)胞線粒體膜電位的損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)Cal27腫瘤干細(xì)胞中caspase-9和caspase-3的活化，見表3。

2.3 歐前胡素通過下調(diào)MCL-1的表達(dá)水平增強(qiáng)Cal27腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，歐前胡素能顯著下調(diào)Cal27腫瘤干細(xì)胞中抗凋亡蛋白MCL-1表達(dá)水平，而順鉑對(duì)MCL-1的表達(dá)無影響。將Cal27腫瘤干細(xì)胞用MCL-1質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染后再用順鉑聯(lián)合歐前胡素進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)MCL-1質(zhì)粒能顯著抑制順鉑聯(lián)合歐前胡素對(duì)Cal27腫瘤干細(xì)胞的殺傷活性和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，見表4。

3 討論

歐前胡素是從白芷根中提取的香豆素類天然活性物質(zhì)，據(jù)報(bào)道有一定的抗腫瘤效應(yīng)，并且能提高化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性[6，8]，然而其對(duì)腫瘤干細(xì)胞的生物作用至今卻仍很少報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，歐前胡素能顯著提高口腔鱗癌干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，證實(shí)歐前胡素聯(lián)合化療藥物對(duì)腫瘤干細(xì)胞治療存在協(xié)同效應(yīng)。

表3 歐前胡素通過線粒體途徑提高Cal27腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性（±s）

表3 歐前胡素通過線粒體途徑提高Cal27腫瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.0；與順鉑+歐前胡素組比較，#P＜0.05；cleaved caspase：活化型半胱天冬酶

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表4 歐前胡素通過MCL-1途徑提高順鉑對(duì)Cal27腫瘤干細(xì)胞的抗腫瘤活性（±s）

表4 歐前胡素通過MCL-1途徑提高順鉑對(duì)Cal27腫瘤干細(xì)胞的抗腫瘤活性（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.0；與順鉑+歐前胡素組比較，#P＜0.05。MCL-1：抗凋亡蛋白

組別對(duì)照組順鉑組歐前胡素組順鉑+歐前胡素組順鉑+歐前胡素+MCL-1質(zhì)粒組孔數(shù) 順鉑（μmol/L）歐前胡素（μmol/L）MCL-1質(zhì)粒（μg/mL）3 3 3 3 3 0 5 0 5 5 0 0 1 0 10 10 0 0 0 0 2 MCL-1相對(duì)表達(dá)水平0.89±0.05 0.90±0.05*#0.29±0.02* 0.31±0.02 0.97±0.06#細(xì)胞活力抑制率（%）0 12.0±0.8*#7.8±0.6*#58.6±3.3 18.4±1.1#細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率（%）2.2±0.3 8.5±0.6*#4.1±0.4*#37.3±2.2 9.9±0.7#

近期研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞的存在是引起腫瘤化療失敗的關(guān)鍵因素，腫瘤干細(xì)胞的高度自我更新能力和對(duì)化療藥物的抵抗性往往導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用順鉑單獨(dú)處理口腔鱗癌細(xì)胞系Cal27后，Cal27細(xì)胞系中CD44陽性的腫瘤干細(xì)胞比例顯著提高，這可能是因?yàn)槟[瘤干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著低于非腫瘤干細(xì)胞，致使Cal27腫瘤干細(xì)胞在順鉑治療下存活下來從而引起所占比例的升高。當(dāng)用歐前胡素進(jìn)行聯(lián)合治療后，由于Cal27腫瘤干細(xì)胞在歐前胡素的作用下對(duì)順鉑的敏感性顯著提高，使腫瘤干細(xì)胞的占比顯著下降，表明歐前胡素能以腫瘤干細(xì)胞為靶點(diǎn)提高順鉑對(duì)口腔鱗癌的治療效果。

CL-1是Bcl-2抗凋亡蛋白家族成員，定位于線粒體外膜上，通過與一些促凋亡蛋白如Bim、Bak和NOXA等形成異二聚體使之失活從而穩(wěn)定線粒體外膜，它能阻斷細(xì)胞色素C等促凋亡物質(zhì)從線粒體中釋放進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，MCL-1在多種腫瘤細(xì)胞中均高表達(dá)，且MCL-1的表達(dá)程度與腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性呈負(fù)相關(guān)[13-14]。在本研究中，歐前胡素在Cal27腫瘤干細(xì)胞中的直接靶點(diǎn)是MCL-1蛋白，它能顯著降低Cal27腫瘤干細(xì)胞中MCL-1的表達(dá)水平。當(dāng)在口腔鱗癌干細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MCL-1質(zhì)粒增加它的表達(dá)水平后，歐前胡素聯(lián)合順鉑對(duì)腫瘤干細(xì)胞線粒體的損傷作用受到顯著抑制，降低細(xì)胞活力抑制力和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率。表明歐前胡素通過抑制MCL-1的表達(dá)發(fā)揮對(duì)順鉑的協(xié)同作用，這些結(jié)果均與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

本研究結(jié)果顯示，歐前胡素能顯著提高口腔鱗癌干細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。其機(jī)制為歐前胡素通過下調(diào)MCL-1的表達(dá)促進(jìn)順鉑對(duì)腫瘤干細(xì)胞線粒體的損傷作用，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞caspase的活化和凋亡的發(fā)生。這些研究為如何提高順鉑治療效果提供了新的思路和理論依據(jù)。

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（收稿：2016-06-03 修回：2016-07-04）

Imperatorin Increased the Sensitivity of Oral Cancer Stem Cells to Cisplatin Via Down-regulating the Ex-pression of MCL-1

XU Xu.Department of Stomatology,Quzhou People's Hospital,Quzhou(324000),China

ObjectiveTo investigate the role of imperatorin in cisplatin-induced cell death in oral cancer stem cells and the underlying mechanism.MethodsThe percentage of cancer stem cell population in the Cal27 cell line treated with imperatorin and cisplatin was assessed by flow cytometry.MTT assay and Annexin V staining was performed to evaluate the effect of imperatorin on the cisplatin-induced cell death and apoptosis in the Cal27 cancer stem cells.ResultsThe Cal27 cancer stem cell population in single cisplatin treatment group was significantly higher than that in control group (19.4%vs 8.5%,P＜0.05),but lower than 11.5%of cisplatin plus imperatorin group(P＜0.05).The inhibitory rate of cell viability and the apoptotic rate of Cal27 cancer stem cells in cisplatin plus imperatorin group was 57.4%±3.4%and 36.7%±2.1%,respectively,which were significantly higher than those in single cisplatin group(7.9%±6.6%and 4.2%±0.4%,P＜0.05)and single imperatorin group(11.8%±0.8%and 8.4%±0.5%,P＜0.05).The mitochondrial transmembrane potential of Cal27 cancer stem cells in cisplatin plus im peratorin group was significantly lower than that in single cisplatin group and single imperatorin group(0.37±0.02 vs 0.96±0.04,0.86±0.03,all P＜0.05).The relative expression of cleaved caspase-9 and caspase-3 in cisplatin plus imperatorin group was significantly higher than that in single cisplatin group and imperatorin group (caspase-9：0.48±0.03 vs 0.03±0.01,0.10±0.02;caspase-3：0.56±0.04 vs 0.03±0.01,0.12±0.02;all P＜0.05).Treatment with im peratorin significantly decreased the expression of MCL-1(0.29±0.02 compared with 0.89±0.05 in control group,P＜0.05), whereas the cisplatin treatment did not change the MCL-1 level(0.90±0.05 vs 0.89±0.05,P＞0.05).Transfectionwith MCL-1 vector significantly impaired the synergistic effect of imperatorin on the cisplatin-induced cell death and apoptosis in the Cal27 cancer stem cells.ConclusionImperatorin increased the sensitivity of oral cancer stem cells to cisplatin via down-regulating the expression of MCL-1.

oral cancer stem cells;MCL-1;imperatorin;cisplatin;mitochondria;apoptosis

浙江省衢州市人民醫(yī)院口腔科（衢州 324000）