巨噬細(xì)胞在骨骼肌損傷再生中的研究進(jìn)展

程建紅，洪莉，洪莎莎，湯劍明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430060)

骨骼肌損傷最常見(jiàn)于交通事故和運(yùn)動(dòng)損傷中，骨骼肌是機(jī)體最具再生能力的組織之一，在骨骼肌受到損傷(牽拉、撕裂、鈍挫等)后數(shù)月，其形態(tài)和功能可在一定程度上恢復(fù)至正常。骨骼肌驚人的再生能力主要依賴于骨骼肌干細(xì)胞，即肌衛(wèi)星細(xì)胞的修復(fù)能力[1]。骨骼肌受到損傷時(shí)，處于靜止?fàn)顟B(tài)的肌衛(wèi)星細(xì)胞激活并增殖形成成肌細(xì)胞，成肌細(xì)胞相互融合分化為多核肌管，肌管新生或與幸存的組織相互融合形成肌纖維，完成骨骼肌損傷后的再生過(guò)程。骨骼肌受到損傷立即觸發(fā)高度協(xié)調(diào)的再生過(guò)程，構(gòu)成由免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞以及調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞因子等組成的復(fù)雜交織的“衛(wèi)星細(xì)胞龕”?？梢?jiàn)，骨骼肌損傷后的再生過(guò)程需要不同細(xì)胞群之間的協(xié)調(diào)作用[2]，其中巨噬細(xì)胞在骨骼肌損傷再生過(guò)程中發(fā)揮不可或缺的作用，是骨骼肌損傷再生中不同生物學(xué)過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，參與炎癥、骨骼肌再生、組織重構(gòu)和血管生成等過(guò)程[3-6]。骨骼肌損傷性疾病一直是全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，缺乏真正有效的治療策略，骨骼肌損傷后的再生研究領(lǐng)域受到廣大科研工作者的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)對(duì)骨骼肌損傷再生過(guò)程中巨噬細(xì)胞的潛在功能以及巨噬細(xì)胞與其他細(xì)胞間的相互作用予以綜述，以期為骨骼肌損傷后再生過(guò)程以及骨骼肌損傷性疾病的研究和治療提供參考。

1 骨骼肌中巨噬細(xì)胞的概述

1.1骨骼肌損傷再生中巨噬細(xì)胞的來(lái)源 巨噬細(xì)胞參與骨骼肌損傷后的再生過(guò)程，其來(lái)源主要有兩種，一種是長(zhǎng)期存在于骨骼肌中的固有巨噬細(xì)胞，終生靜息存留在健康骨骼肌內(nèi)，在骨骼肌發(fā)生病損時(shí)發(fā)揮作用[7]；另一種是骨骼肌損傷后來(lái)源于骨髓的浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞，在骨骼肌病變時(shí)侵入骨骼肌。骨骼肌固有巨噬細(xì)胞源自胚胎期的卵黃囊，成年后定植于骨骼肌中，可通過(guò)原位增殖進(jìn)行自我更新補(bǔ)充[8]。從外周循環(huán)招募的浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞由造血干細(xì)胞經(jīng)由單核細(xì)胞分化形成。與浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞不同，骨骼肌固有巨噬細(xì)胞不具有吞噬能力[9]。骨骼肌固有巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是一種“哨兵”，容易被骨骼肌損傷時(shí)分泌的損傷相關(guān)分子模式激活，具有促進(jìn)其他炎癥細(xì)胞募集的功能。目前，盡管固有巨噬細(xì)胞的起源和組織特異性功能已在許多其他組織中得到廣泛研究，但它們?cè)诠趋兰≈械奶卣魃胁幻鞔_，其在骨骼肌損傷再生中的潛在作用需要進(jìn)一步研究。

1.2骨骼肌損傷部位巨噬細(xì)胞的募集及對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié) 巨噬細(xì)胞是骨髓和外周淋巴組織中的主要髓系細(xì)胞，在骨骼肌損傷后炎癥初期，從外周循環(huán)募集至損傷部位成為骨骼肌中的炎癥性巨噬細(xì)胞。首先，源自骨髓活化的單核細(xì)胞黏附在血管內(nèi)壁上，滾動(dòng)并遷移至損傷部位，在損傷部位進(jìn)一步分化發(fā)育成巨噬細(xì)胞。單核細(xì)胞根據(jù)不同的滲出機(jī)制和Ly6C蛋白表達(dá)水平，可分化成兩種不同功能狀態(tài)的巨噬細(xì)胞亞群，即Ly6Chi巨噬細(xì)胞亞群和Ly6Clo巨噬細(xì)胞亞群[10-11]。通過(guò)CC趨化因子受體2招募的Ly6Chi巨噬細(xì)胞在炎癥早期率先募集，表現(xiàn)為促炎特性。而依賴于CX3C趨化因子受體1招募的Ly6Clo巨噬細(xì)胞則較晚出現(xiàn)，表現(xiàn)出抗炎特性。

骨骼肌損傷后24 h內(nèi)，外周循環(huán)中的Ly6Chi巨噬細(xì)胞侵入骨骼肌損傷部位，其數(shù)量顯著增加，并持續(xù)增加至傷后2 d。骨骼肌損傷后第2天開(kāi)始，Ly6Chi巨噬細(xì)胞數(shù)量開(kāi)始減少，Ly6Clo巨噬細(xì)胞開(kāi)始聚集，隨后幾乎所有的LyC6hi巨噬細(xì)胞都被Ly6Clo巨噬細(xì)胞取代，Ly6Clo巨噬細(xì)胞數(shù)一般在傷后4 d時(shí)達(dá)到最高峰，并在數(shù)天內(nèi)維持在較高水平[11]。Ly6Clo巨噬細(xì)胞參與骨骼肌再生的后期階段，即新肌纖維的形成和生長(zhǎng)、組織重構(gòu)、血管生成等[12]。一旦肌纖維再生結(jié)束且恢復(fù)至穩(wěn)態(tài)，巨噬細(xì)胞數(shù)量降至正常水平。與此同時(shí)，巨噬細(xì)胞停止分泌促炎因子或抗炎因子，轉(zhuǎn)為一種向內(nèi)穩(wěn)態(tài)回歸的沉默模式[3]。Arnold等[11]發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌再生的初始階段，阻斷單核細(xì)胞進(jìn)入骨骼肌損傷部位可減輕炎癥反應(yīng)，但同時(shí)會(huì)延遲且減少Ly6Chi巨噬細(xì)胞的募集，進(jìn)而阻礙Ly6Clo巨噬細(xì)胞的正常募集和作用發(fā)揮，最終導(dǎo)致肌肉無(wú)效再生。由此可見(jiàn)，Ly6Clo和Ly6Chi巨噬細(xì)胞在骨骼肌損傷再生過(guò)程中有效和有序的募集是骨骼肌損傷后再生的關(guān)鍵，兩者缺一不可。因此，過(guò)度的抑制炎癥不利于骨骼肌的再生。

骨骼肌損傷后首先發(fā)生炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞參與骨骼肌損傷后炎癥反應(yīng)的全過(guò)程，即炎癥的發(fā)生、發(fā)展和消退是協(xié)調(diào)炎癥細(xì)胞聚集和發(fā)揮功能的關(guān)鍵細(xì)胞。炎癥開(kāi)始時(shí)，定植于骨骼肌中的固有巨噬細(xì)胞被激活分泌中性粒細(xì)胞趨化因子1、單核細(xì)胞趨化因子1促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的募集[6]。同時(shí)，黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的巡邏單核細(xì)胞在骨骼肌損傷后1 h內(nèi)迅速到達(dá)骨骼肌損傷部位，分泌大量的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的募集[13]，此外，巡邏單核細(xì)胞還可通過(guò)與中性粒細(xì)胞直接物理接觸延長(zhǎng)中性粒細(xì)胞在損傷部位的停留時(shí)間，使中性粒細(xì)胞充分發(fā)揮吞噬作用，清除骨骼肌壞死組織碎片以及釋放促炎癥因子擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[14]。

骨骼肌損傷后中性粒細(xì)胞在2 h內(nèi)迅速到達(dá)損傷部位，數(shù)量迅速增加，傷后6～24 h達(dá)到最高峰，然后數(shù)量急劇下降。中性粒細(xì)胞到達(dá)損傷部位后通過(guò)吞噬作用釋放活性氧類、蛋白酶，刺激宿主啟動(dòng)防御功能并清除病變壞死組織細(xì)胞碎片[15]。因此，在骨骼肌再生過(guò)程中，缺失中性粒細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致壞死組織持續(xù)存在，進(jìn)而造成骨骼肌再生延遲[16]。此外，中性粒細(xì)胞通過(guò)分泌巨噬細(xì)胞炎癥因子1和單核細(xì)胞趨化因子1刺激炎癥發(fā)展，并通過(guò)上述細(xì)胞因子招募外周循環(huán)中的單核細(xì)胞至骨骼肌受損部位[17]。隨后，Ly6hi巨噬細(xì)胞大量滲入骨骼肌受損部位，并通過(guò)分泌促炎因子[如TNF-α和白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6]進(jìn)一步促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的募集[17-18]，這種促炎環(huán)境在損傷后48 h左右達(dá)到高峰；此后，Ly6lo巨噬細(xì)胞成為再生骨骼肌中的主要巨噬細(xì)胞亞群抑制炎癥的發(fā)展。

骨骼肌損傷后第5天炎癥進(jìn)入消退階段，炎癥消退不是由促炎信號(hào)減少引起的被動(dòng)過(guò)程，而是多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的主動(dòng)過(guò)程[19]。Ly6lo巨噬細(xì)胞分泌大量的抗炎因子，如IL-4、IL-13，積極促進(jìn)炎癥的消退。除可以減少促炎信號(hào)和活性氧類的產(chǎn)生外，上述細(xì)胞因子還可以阻止中性粒細(xì)胞的募集，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡以及巨噬細(xì)胞的非炎性吞噬[19]?？傊?，巨噬細(xì)胞始終在炎癥發(fā)生、發(fā)展、消退中起著核心作用。

2 巨噬細(xì)胞調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞的再生能力

巨噬細(xì)胞在骨骼肌再生過(guò)程中參與調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化。Saclier等[20]體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基在體外可觸發(fā)成肌細(xì)胞增殖，在體內(nèi)可促進(jìn)骨骼肌再生。此外，Juhas等[21]對(duì)體外構(gòu)建的3D骨骼肌模型的研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是組織損傷后修復(fù)所必需的，巨噬細(xì)胞具有刺激骨骼肌再生的重要作用。Arnold等[11]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Ly6hi巨噬細(xì)胞通過(guò)釋放促炎細(xì)胞因子促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制其分化，Ly6lo巨噬細(xì)胞釋放的抗炎細(xì)胞因子抑制成肌細(xì)胞增殖而刺激其分化和融合。目前，調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞功能的旁分泌因子的具體成分尚未明確，然而，巨噬細(xì)胞分泌的部分細(xì)胞因子參與了調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞的功能。如Ly6hi巨噬細(xì)胞高表達(dá)的細(xì)胞因子——IL-6[22]、TNF-α[23]和前列腺素E2[24]均刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖。且Ly6hi巨噬細(xì)胞分泌的去整合素樣金屬蛋白酶可減少Notch信號(hào)通路，從而促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞激活和骨骼肌再生[25]。另一方面，Ly6lo巨噬細(xì)胞高表達(dá)的IL-4[26]和胰島素樣生長(zhǎng)因子1[27]可刺激成肌細(xì)胞分化、融合和肌纖維生長(zhǎng)。

綜上所述，在肌肉損傷的早期階段，浸潤(rùn)的Ly6hi巨噬細(xì)胞在肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖中起重要作用，而Ly6lo巨噬細(xì)胞在肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化中起重要作用。骨骼肌損傷后再生過(guò)程中，由于不同的巨噬細(xì)胞亞群對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞的作用不同，Ly6hi和Ly6lo巨噬細(xì)胞在時(shí)間和空間上緊密協(xié)調(diào)，在骨骼肌損傷后再生中具有重要價(jià)值。

3 巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞龕相關(guān)成分

骨骼肌干細(xì)胞(即肌衛(wèi)星細(xì)胞)處于特殊微環(huán)境中，這種特殊微環(huán)境通常被稱為“衛(wèi)星細(xì)胞龕”。除調(diào)節(jié)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的作用外，巨噬細(xì)胞還參與衛(wèi)星細(xì)胞龕相關(guān)成分的調(diào)節(jié)。其中，巨噬細(xì)胞通過(guò)調(diào)控纖維/脂肪形成祖細(xì)胞(fibro/adipogenic progenitors，F(xiàn)APs)的功能調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)血管的新生，進(jìn)而促進(jìn)骨骼肌損傷后的修復(fù)。

3.1巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)骨骼肌損傷后細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu) 除肌衛(wèi)星細(xì)胞外，F(xiàn)APs也參與了骨骼肌損傷后的再生，并對(duì)骨骼肌再生起至關(guān)重要的作用。在骨骼肌損傷后有規(guī)律的再生過(guò)程中，F(xiàn)APs細(xì)胞數(shù)量在早期(1～3 d)增加，在晚期(4～7 d)減少。損傷后FAPs的增加對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)成分的產(chǎn)生至關(guān)重要，細(xì)胞外基質(zhì)成分是穩(wěn)定組織所必需的，可作為新纖維的支架被肌衛(wèi)星細(xì)胞用作基膜，以維持肌纖維的類似排列。當(dāng)骨骼肌損傷時(shí)，F(xiàn)APs可促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活和分化，而肌衛(wèi)星細(xì)胞抑制FAPs向脂肪細(xì)胞的分化[28-29]。Lemos等[5]研究證實(shí)，Ly6hi巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌TNF-α直接刺激FAPs的凋亡來(lái)調(diào)控FAPs的聚集。此外，Cordani等[30]體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ly6hi巨噬細(xì)胞分泌的一氧化氮抑制FAPs向脂肪細(xì)胞分化；而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其可減少骨骼肌內(nèi)脂肪和結(jié)締組織的沉積。在骨骼肌再生過(guò)程中，Ly6lo巨噬細(xì)胞可高表達(dá)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β可阻斷TNF-α誘導(dǎo)的FAPs凋亡，并誘導(dǎo)FAPs沿纖維化譜系分化。因此，Ly6lo巨噬細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β是FAPs在促炎反應(yīng)后生存所必需的，這對(duì)骨骼肌愈合后期的組織重塑非常重要。Ploeger等[31]通過(guò)將成纖維細(xì)胞與不同亞群巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)證實(shí)，Ly6lo巨噬細(xì)胞可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成，而Ly6hi巨噬細(xì)胞則通過(guò)分泌降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶1和基質(zhì)金屬蛋白酶2減少膠原合成。

在骨骼肌損傷后的再生過(guò)程中，Ly6hi巨噬細(xì)胞和Ly6lo巨噬細(xì)胞之間的平衡和時(shí)間依賴性調(diào)控能通過(guò)FAPs調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化、新生肌纖維發(fā)生、骨骼肌正常修復(fù)中發(fā)揮作用。

3.2巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能 骨骼肌損傷后，血管細(xì)胞與肌衛(wèi)星細(xì)胞通過(guò)相互作用促進(jìn)血管新生，對(duì)骨骼肌損傷后恢復(fù)非常重要。內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)分泌多種生長(zhǎng)因子(如胰島素樣生長(zhǎng)因子1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)參與調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞的生長(zhǎng)，分化后的成肌細(xì)胞可反向刺激血管生成[32]。Birbrai等[33]發(fā)現(xiàn)，與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞毗鄰的周細(xì)胞亦具有刺激成肌細(xì)胞增殖的能力。

巨噬細(xì)胞具有調(diào)節(jié)血管新生的作用。Heil等[34]發(fā)現(xiàn)，CC趨化因子受體2缺陷小鼠中浸潤(rùn)的單核細(xì)胞的缺失損害了缺血后肢動(dòng)脈側(cè)支的形成，但不同亞群巨噬細(xì)胞在血管形成中的作用仍存在爭(zhēng)議。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是抗炎巨噬細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特亞群，其具有明確的促血管生成作用[35]。然而，不同巨噬細(xì)胞亞群在非腫瘤形成環(huán)境中的作用不同。Zajac等[36]體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抗炎巨噬細(xì)胞促進(jìn)新生血管形成的作用較促炎巨噬細(xì)胞更強(qiáng)。Spiller等[37]的體外模型顯示，內(nèi)毒素和γ干擾素誘導(dǎo)刺激的促炎巨噬細(xì)胞促進(jìn)血管出芽的長(zhǎng)度和數(shù)量高于由IL-4和IL-13誘導(dǎo)刺激的抗炎M2a巨噬細(xì)胞，但低于由IL-10誘導(dǎo)刺激的抗炎M2c巨噬細(xì)胞。隨后，Latroche等[38]將內(nèi)皮細(xì)胞、成肌細(xì)胞和IL-4或IL-10誘導(dǎo)刺激的巨噬細(xì)胞體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，抗炎巨噬細(xì)胞可通過(guò)分泌抑瘤素M調(diào)控血管新生和骨骼肌再生。總體而言，巨噬細(xì)胞在骨骼肌損傷后血管新生的調(diào)節(jié)中起重要作用；然而，不同巨噬細(xì)胞亞群的具體作用還需進(jìn)一步研究的明確。

4 小 結(jié)

骨骼肌損傷后的驚人再生能力主要依賴于骨骼肌干細(xì)胞——肌衛(wèi)星細(xì)胞，肌衛(wèi)星細(xì)胞是骨骼肌損傷后再生過(guò)程中發(fā)揮作用的主要細(xì)胞，但仍需要其他細(xì)胞的協(xié)同作用，特別是巨噬細(xì)胞。骨骼肌損傷時(shí)，Ly6hi巨噬細(xì)胞通過(guò)放大炎癥信號(hào)、吞噬組織碎片、產(chǎn)生細(xì)胞因子激活肌衛(wèi)星細(xì)胞并促進(jìn)其增殖。與Ly6hi巨噬細(xì)胞不同，Ly6lo巨噬細(xì)胞通過(guò)減弱炎癥反應(yīng)促進(jìn)成肌細(xì)胞分化、融合和骨骼肌再生。此外，巨噬細(xì)胞還參與骨骼肌干細(xì)胞龕相關(guān)成分的調(diào)節(jié)，如通過(guò)調(diào)控FAPs功能調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，或通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的功能誘導(dǎo)調(diào)節(jié)骨骼肌損傷后血管新生?，F(xiàn)已證實(shí)，巨噬細(xì)胞在損傷骨骼肌中對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞和“衛(wèi)星細(xì)胞龕”具有調(diào)節(jié)作用,但如何更好地利用巨噬細(xì)胞對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞及其細(xì)胞龕進(jìn)行有效調(diào)控，使其在骨骼肌損傷再生過(guò)程中發(fā)揮最佳作用，還有待進(jìn)一步研究探索。因此，進(jìn)一步深入系統(tǒng)地研究巨噬細(xì)胞在骨骼肌損傷再生過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制，將為探索出以調(diào)控巨噬細(xì)胞促進(jìn)骨骼肌損傷再生為重要方向的治療方法提供新的思路和靶點(diǎn)，可能成為今后研究的熱點(diǎn)之一。