LC-MS/MS法測定蒸餾酒中環(huán)己基氨基磺酸鈉的不確定度評定

王文鵬，蘇美東，王 濤

（1.延安市食品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測中心，陜西延安 716000；2.陜西省質(zhì)量認(rèn)證認(rèn)可協(xié)會(huì)，陜西西安 710000）

不確定度的含義是指由于測量誤差的存在，對被測量值的不能肯定的程度?！稒z驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評價(jià) 檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)通用要求》（RB/T 214—2017）4.5.15要求檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)需要建立和保持應(yīng)用評定測量不確定度的程序[1]。環(huán)己基氨基磺酸鈉（Sodium N-cyclohexylsulfamate），俗稱甜蜜素，是一種常用甜味劑，其甜度是蔗糖的30～40倍[2]。其毒理學(xué)顯示：小鼠經(jīng)口半數(shù)致死劑量為 18 g/kg，F(xiàn)AO/WHO（1982）規(guī)定每日允許攝入量為0～11 mg/kg[3]。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）對食品中甜蜜素用量進(jìn)行了嚴(yán)格限制，其中蒸餾酒中不得添加甜蜜素[4]。該研究工作在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》（GB 5009.97—2016）[5]第3法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法為基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-11]，對蒸餾酒中環(huán)己基氨基磺酸鈉含量的不確定度進(jìn)行評定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LCMS8040三重四級桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI源），日本島津；渦旋混合器，IKA；電子天平（感量為0.001 g和0.01 mg），梅特勒。

環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由壇墨質(zhì)檢提供，純度99.9%；甲醇、甲酸、乙酸銨均為色譜純。

1.2 試驗(yàn)步驟與方法

按照國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》（GB 5009.97—2016）[5]。稱取酒樣10.0 g，置于50 mL燒杯中，于60 ℃水浴上加熱30 min，殘?jiān)哭D(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容并搖勻，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取0.118 21 g環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至100 mL，混勻，溶液折算為環(huán)己基氨基磺酸1.052 mg/mL（環(huán)己基氨基磺酸鈉與環(huán)己基氨基磺酸的換算系數(shù)為0.890 9），作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用水將1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液定容至100 mL，濃度為10.52 μg/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)中間液。

環(huán)己基氨基磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液：分別吸取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)中間液，用水稀釋，配成濃度分別為0.010 52 μg/mL、0.052 60 μg/mL、0.105 2 μg/mL、0.526 0 μg/mL、1.052 μg/mL 和 2.104 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：C18柱，粒徑1.7 μm，150 mm×2.1 mm（島津）；流動(dòng)相：A為10 mmol/L乙酸銨溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序見GB 5009.97—2016第三法；流速：0.25 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI源）；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；掃描方式：正負(fù)離子模式掃描；碰撞氣：氬氣；接口溫度：300 ℃；DL管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃。選擇的離子對參數(shù)見表1。

表1 定性、定量離子對和質(zhì)譜分析參數(shù)

1.4.3 建立數(shù)學(xué)模型

結(jié)果計(jì)算如下：

其中：X-試樣中各待測組分的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；C-從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線中讀出的供試品溶液中各待測組分的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；V-試樣溶液最終定容體積，單位為毫升（mL）；m-稱樣量，單位為克（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的識別

由試驗(yàn)方法、結(jié)果計(jì)算過程，可以看到不確定度的來源主要有樣品稱量、稀釋體積、標(biāo)準(zhǔn)溶液及其配制、校準(zhǔn)曲線擬合、樣品測定等因素引入的不確定度。

2.2 樣品稱量的不確定度U1

稱取10 g的酒樣。所用天平檢定證書給出的最大允差為±1.0 mg，取均勻分布，則樣品稱量相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 樣品稀釋體積的不確定度U2

樣品稀釋體積的不確定主要來源于容量瓶中的校準(zhǔn)、重復(fù)性的貢獻(xiàn)。其他如溫度、玻璃的膨脹系數(shù)所引起的不確定貢獻(xiàn)較小[8]。

20 ℃時(shí)100 mL容量瓶（A級）的容量允差為±0.10 mL，取均勻分布，其不確定度為：

取100 mL容量瓶重復(fù)充滿10次，稱量，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.2 mL，重復(fù)性不確定度為：

因此樣品稀釋帶入的相對不確定度為：

2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋及配置不確定度U3

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確信度

查閱的環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，其相對擴(kuò)展不確定度均為0.5%，由于未顯示自由度，按矩形分布，則其相對不確定度Ustd：

所用所用天平檢定證書給出的最大允差為±0.02 mg，取均勻分布，則樣品稱量相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

（2）10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制引入的不確定度。配制時(shí)使用1 mL移液器分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1 mL于100 mL的容量瓶，用水定容，配制成10 μg/mL混合溶液。此過程中使用100 mL容量瓶引入的不確定度為0.000 58。

1 mL移液器的校準(zhǔn)證書顯示容量誤差為0.3%（k=2），其相對不確定度為：

則標(biāo)準(zhǔn)儲備液的不確定合成為：

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制的不確定度

分別采用100 μL和1 mL移液器取標(biāo)準(zhǔn)中間液 0.01 μL、0.05 μL、0.1 μL、0.5 μL、1.0 μL 和2.0 μL至10 mL容量瓶中，用水定容至刻度。兩支移液器分別使用了3次。1 mL移液器引入不確定度見2.4.2（2），其使用了3次，則不確定度為0.001 2×3=0.003 6，同理 100 μL 不確定度為 0.005 5×3=0.016 5，10 mL容量瓶引入的不確定度為0.001 2，則標(biāo)準(zhǔn)曲線配制的不確定度為：

則標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋及配制不確定度為：

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過單因素試驗(yàn)確定各因素變量范圍，選擇提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)及液料比(C)為主要影響因素。運(yùn)用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素及水平編碼如表1所示。根據(jù)公式(1)計(jì)算出多元二次回歸數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸分析。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度U4

標(biāo)準(zhǔn)曲線由6個(gè)質(zhì)量濃度水平，分別是0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL 和2.0 μg/mL；每個(gè)質(zhì)量濃度測定3次，樣品溶液測定6次，按照外標(biāo)法擬合，測得環(huán)己基氨基磺酸的線性方程為Y=379 928X-35 038.67，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，測得蒸餾酒樣品平均值濃度為0.976。

式中：p-樣品測定次數(shù)；n-標(biāo)準(zhǔn)溶液測定總次數(shù)；Ci-樣品平均質(zhì)量濃度，μg/mL；C—-標(biāo)準(zhǔn)溶液平均質(zhì)量濃度，μg/mL；Cj-各標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度，μg/mL；Yj-各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)的峰面積；A-校準(zhǔn)曲線截距；B-校準(zhǔn)曲線斜率。

計(jì)算所得：Sxx=10.06（μg/mL）2；Sy=9 427.3 μg/mL；U曲=0.013 34 μg/mL。

則由標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對不確定度為：

2.6 樣品測定引入的不確定度

取樣品6份，按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定制成溶液，測定6次，計(jì)算環(huán)己基氨基磺酸鈉（以環(huán)己基氨基磺酸計(jì)）的含量，結(jié)果見表2。環(huán)己基氨基磺酸鈉含量的平均值為9.49 mg/kg，樣品測定引入的不確定度可以用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來確定，為0.004 6。

表2 白酒樣品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的含量

樣品測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

2.7 相對不確定度的合成

2.7.1 合成不確定度

根據(jù)各不確定度分量計(jì)算環(huán)己基氨基磺酸鈉（以環(huán)己基氨基磺酸計(jì)）測定值的合成相對不確定度U為：

2.7.2 擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2（置信區(qū)間95%），白酒樣品中環(huán)己基氨基磺酸鈉（以環(huán)己基氨基磺酸計(jì)）的擴(kuò)展不確定度計(jì)算為：

3 結(jié)論

白酒中環(huán)己基氨基磺酸鈉（以環(huán)己基氨基磺酸計(jì)）的測定結(jié)果為（9.49±0.428） mg/kg。通過對不確定度各分量的分析，可以得出標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線是不確定度的主要來源，其次是樣品測定，其他分量貢獻(xiàn)較小，因此優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法和增加樣品測定次數(shù)是減小不確定度的有效途徑。