銅綠假單胞菌快速檢測方法的優(yōu)化研究

單 萌，周 婀，馬 瑜

（1.上?？底R食品科技有限公司，上海 201101；2.陜西省微生物研究所，陜西西安 710043）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），屬假單胞菌屬，廣泛分布于水、土壤、空氣、植物、污水、醫(yī)院、動物及人體內(nèi)等各類環(huán)境中，是一種常見的水源性和食源性條件致病菌[1-3]。該菌可引起機體組織器官病變甚至壞死，進而引起腸胃炎、敗血癥等病癥及不同程度的人畜共患性傳染?。煌瑫r，其產(chǎn)生的多種致病因子容易引起免疫力低下及受抑制人群或長期使用抗生素人群的化膿性感染和耐藥性問題[4-5]。此外，銅綠假單胞菌形成生物膜后，對干燥、紫外線、消毒劑等理化因素及不良環(huán)境具有較強的抵抗力；且由該菌污染引起的產(chǎn)品腐敗會嚴重影響產(chǎn)品品質(zhì)，導致經(jīng)濟損失。因此，實現(xiàn)銅綠假單胞菌準確、快速檢測一直是食品加工業(yè)的關(guān)注重點和迫切需求[6]。

利用培養(yǎng)基對微生物菌群中特定微生物具有選擇性的這一特征，可以通過不同的選擇性培養(yǎng)基從環(huán)境中對微生物進行分離。而關(guān)于銅綠假單胞菌的檢測主要依賴于培養(yǎng)方法，其中最為關(guān)鍵的是選擇合適的培養(yǎng)基。目前，已有多種選擇性培養(yǎng)基，如抗生素篩選培養(yǎng)基[7]、色素篩選培養(yǎng)基[8]及乙酰胺培養(yǎng)基[9]可用于假單胞菌的分離篩選。我國關(guān)于銅綠假單胞菌的檢測大多依據(jù)GB 7918.4—1987[10]和GB 8538—2016[11]，此外，國標GB 19298—2014中明確規(guī)定各類抽檢水樣品中均不得檢出銅綠假單胞菌[12]。但上述標準中的檢測方法主要依賴于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、形態(tài)學觀察及生化鑒定等檢測手段，檢測耗時長、過程煩瑣、且容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，不利于企業(yè)快速判斷結(jié)果，進而造成檢測結(jié)果滯后。因此，實現(xiàn)銅綠假單胞菌的快速、準確檢測具有重要意義。

隨著人們生活水平和對健康意識的不斷提高，包裝飲用水成為了許多家庭和集體飲用水的首選。近年來，隨著包裝飲用水的消費數(shù)量的不斷上升、產(chǎn)品種類及包裝方式的多元化，包裝飲用水中檢出銅綠假單胞菌的報道逐漸增多，原有的傳統(tǒng)檢測方法已難以滿足當前的生產(chǎn)需求[13]。本研究同時對用于銅綠假單胞菌檢測的4種不同培養(yǎng)基的篩選效力及選擇性進行了評價，進而通過將選擇性培養(yǎng)基鑒定結(jié)果與VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDITOF-MS）結(jié)合，對不同檢測技術(shù)、方法的有效性、適用性及相互之間的融合性進行了比較和分析，以期提升銅綠假單胞菌的檢測效率及準確度。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標準菌株共5株，包括：銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC27853（N-1）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922（N-2）、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）ATCC13525（N-3）、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltrophilia）ATCC51331（N-4）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingobacterium）ATCC31555（N-5），為廣東微生物菌種保藏中心保藏菌種。其中，銅綠假單胞菌N-1（P. aeruginosa）ATCC27853作為陽性對照，其余菌株為陰性對照。G-1（銅綠假單胞菌，P.aeruginosa）、G-2（銅綠假單胞菌，P.aeruginosa）、G-3(銅綠假單胞菌，P.aeruginosa）、G-4（惡臭假單胞菌，Pseudomonas putida）、G-5（少動鞘氨醇單胞菌，Sphingomonas paucimobilis）為本實驗室保存菌株，乙酰胺實驗結(jié)果均呈陽性。其中，G-1、G-2、G-3分離自水源水，G-4、G-5分離自產(chǎn)品水。

營養(yǎng)瓊脂、假單胞菌瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基/CN瓊脂、平板計數(shù)培養(yǎng)基/PCA瓊脂、乙酰胺培養(yǎng)基、乙酰胺肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；RAPID’P.aeruginosa Agar（BIO-RAD）。

VITEK 2 Compact 30全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（梅里埃）；基質(zhì)輔助激光電離解析飛行時間質(zhì)普（MALDI-TOF MS Biotyper System）（布魯克）；1～ 1000 μL 移液器（Eppendorf）；LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安）；VORTEX-6渦旋振蕩儀（其林貝爾）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化

將-80 ℃保存的5株標準菌株與5株實驗室保存菌株劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，于36 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代2次，得到活化菌株[14]。

1.2.2 不同選擇培養(yǎng)基特異性比較

（1）特異性比較。將10株菌株分別劃線接種在營養(yǎng)瓊脂、CN瓊脂、乙酰胺培養(yǎng)基、RAPID’s P.aeruginosa Agar4種培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)24 h，比較4種培養(yǎng)基對試驗菌株的特異性。

（2）適用性比較。將10株菌株制成不同濃度（10-2～10-6CFU）的菌懸液，按照GB 8538—2016的方法對水樣進行過濾，將濾膜轉(zhuǎn)至營養(yǎng)瓊脂、CN瓊脂、乙酰胺培養(yǎng)基、RAPID’s P.aeruginosa Agar4種培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察比較對試驗菌株在4種培養(yǎng)基上的生長狀況及顯色反應(yīng)。

1.2.3 人工模擬污染試驗

如表1所示，將2～4種菌混合，制備成10-1CFU的混合菌懸液，梯度稀釋至10-5CFU，取0.2 mL菌液加入250 mL模擬水樣中，按照GB 8538—2016的方法對水樣進行過濾，將濾膜轉(zhuǎn)至乙酰胺培養(yǎng)基及RAPID’s P.aeruginosa Agar，36 ℃培養(yǎng)24 h，觀察、比較兩種培養(yǎng)基的檢驗效果。

表1 人工模擬污染試驗菌株組合

1.2.4 VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)鑒定方法

將活化后的菌株進行革蘭氏染色，于光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)及染色結(jié)果，根據(jù)染色結(jié)果和菌體形態(tài)選擇相應(yīng)的鑒定卡。用一次性接種環(huán)挑取待測菌株單菌落至含3 mL 0.45% NaCl溶液的一次性懸浮試管中，調(diào)節(jié)麥氏濃度至0.5～0.6左右，填充對應(yīng)鑒定卡，采用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進行系統(tǒng)鑒定。

1.2.5 基質(zhì)輔助激光電離解析飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS Biotyper System）鑒定方法

根據(jù)MALDI-TOF MS Biotyper System操作規(guī)程，用一次性接種環(huán)挑取新鮮待測菌株單菌落涂布于MALDI靶板，滴加1 μL濃度為70%的甲酸溶液，室溫下晾干，覆蓋1 μL基質(zhì)液，室溫下自然晾干后上機測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

MALDI-TOF鑒定結(jié)果用Biotyper 3.1 database分析；其余結(jié)果采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同選擇培養(yǎng)基特異性比較

2.1.1 特異性比較

10株菌株在4種培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后的生長狀況如表2所示。由表2可知，在營養(yǎng)瓊脂、CN瓊脂及乙酰胺瓊脂培養(yǎng)基上，銅綠假單胞菌菌落無法與其他的假單胞菌和大腸菌群區(qū)分開來；在RAPID’s P.aeruginosa Agar上，銅綠假單胞菌呈現(xiàn)藍綠色，其他菌種在該培養(yǎng)基上不生長或菌落顏色呈白色或淡黃色，可有效、快速的區(qū)分銅綠假單胞菌與其他菌群。

表2 試驗菌株在不同培養(yǎng)基上的生長特異性比較

2.1.2 適用性比較

由表3可知，通過不同菌濃度的試驗可知，膜片上高濃度銅綠假單胞菌可能會使乙酰胺培養(yǎng)基呈玫紅色，低濃度銅綠假單胞菌不一定會使培養(yǎng)基呈玫紅色；標準菌株顯色效果要優(yōu)于從水源水中檢出銅綠假單胞菌；此外，惡臭假單胞菌可使乙酰胺培養(yǎng)基變色呈玫紅色。因此，實際操作中在乙酰胺培養(yǎng)基上無法直接有效區(qū)分銅綠假單胞菌與其他的菌落。不同菌濃度樣品的濾膜在RAPID’s P.aeruginosa Agar上表現(xiàn)一致，銅綠假單胞菌呈藍綠色，其他菌種在該培養(yǎng)基上不生長或菌落顏色呈白色或淡黃色。因此，如使用濾膜法進行銅綠假單胞菌的檢測，若使用乙酰胺培養(yǎng)基進行篩選，有可能會造成結(jié)果假陰性或假陽性的出現(xiàn)。而在RAPID’s P.aeruginosa Agar上的試驗，濾膜法與直接劃線法結(jié)果一致。

表3 兩種選擇性培養(yǎng)基篩選效果的適用性比較

2.2 人工模擬污染試驗分析

RAPID’s P.aeruginosa Agar上，銅綠假單胞菌呈藍綠色，干擾菌不生長或呈白色，其他菌不會干擾其在膜片上的生長；而乙酰胺培養(yǎng)基上不能分辨出銅綠假單胞菌與其他菌落。

2.3 VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果

所有菌株均為革蘭氏陰性菌株，VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果見表4。VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)對5株標準菌株的鑒定結(jié)果符合率為100%，其余5株保存菌株中G-1（99%）、G-2（98%）、G-3（99%）鑒定為銅綠假單胞菌。10株菌株中陽性菌株為4株，陰性菌株為6株，4株銅綠假單胞菌全部被檢出。

2.4 基質(zhì)輔助激光電離解析飛行時間質(zhì)普（MALDITOF MS）鑒定結(jié)果

10株菌經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定得到的結(jié)果與VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定所得鑒定結(jié)果一致，如表4所示。

表4 試驗菌株鑒定結(jié)果

2.5 銅綠假單胞菌檢驗方法的優(yōu)化及驗證

結(jié)合人工模擬污染試驗與兩種不同鑒定系統(tǒng)的檢驗結(jié)果，對銅綠假單胞菌檢驗方法進行適當優(yōu)化，如圖1所示。優(yōu)化后的檢驗程序主要分為兩部分：①參考GB 8538—2016的方法對水樣進行過濾，將濾膜轉(zhuǎn)至RAPID’s P.aeruginosa Agar培養(yǎng)基上，36 ℃培養(yǎng)22～30 h；②利用VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)對RAPID’s P.aeruginosa Agar平板上典型藍綠色菌落進行鑒定。以檢驗程序兩部分的結(jié)果均為陽性時，判定為銅綠假單胞菌，其余結(jié)果為陰性。

圖1 優(yōu)化后的銅綠假單胞菌檢驗程序

采用優(yōu)化后的方法對1.2.3中的人工模擬污染試驗水樣進行驗證試驗，結(jié)果如圖2所示。優(yōu)化后的方法在快速識別銅綠假單胞菌與其他干擾菌（呈白色）的同時，實現(xiàn)了疑似菌落的快速鑒定。所得鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)鑒定方法一致。

圖2 銅綠假單胞菌檢出情況及其在不同培養(yǎng)基生長情況比較

3 結(jié)論與討論

銅綠假單胞菌作為一類致病性較低但耐藥性強的細菌，可以長期在水環(huán)境中生存，是水質(zhì)監(jiān)測的重要指標之一。隨著銅綠假單胞菌污染飲用水及耐藥性等問題的逐漸突出，選擇適合生產(chǎn)企業(yè)的簡便、準確、高效的快速檢測方法，已成為當前產(chǎn)業(yè)界和保障人們食品安全的迫切需求?，F(xiàn)有國標中使用的傳統(tǒng)方法涉及濾膜過濾、微生物培養(yǎng)觀察鑒別及驗證、氧化酶試驗、產(chǎn)氨試驗等，由于試驗過程操作煩瑣、工作量大、成本高且耗時長，已難以滿足當前食品安全生產(chǎn)的需求。而針對假單胞菌的選擇性的開發(fā)是一個長期的挑戰(zhàn)。此外，不同檢測技術(shù)（或方法）的有效性、適用性及相互之間的融合性也成為了提升檢測效率和質(zhì)量的關(guān)鍵。隨著微生物快速檢測技術(shù)的不斷進步，VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）已被廣泛用于常規(guī)試驗微生物，特別是銅綠假單胞菌的檢測與鑒定[15-17]。

為快速、有效地區(qū)分銅綠假單胞菌與其他干擾菌，本研究通過對不同選擇性培養(yǎng)基檢測效果進行比較發(fā)現(xiàn)，乙酰胺瓊脂上銅綠假單胞菌的特異性較差，會出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，而銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基（RAPID’s P.aeruginosa Agar）憑借其典型的菌落特征以及較短的增菌時間，適合對大批量樣品進行快速判定。VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)及其所攜帶的分析系統(tǒng)可在快速完成菌種鑒定的同時對獲得數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析，操作過程安全、快速、準確、重復(fù)性好[18-19]。目前，該系統(tǒng)已被應(yīng)用于中華人民共和國國家標準中關(guān)于沙門氏菌、單增李斯特氏菌和副溶血性弧菌的檢驗過程中[20-22]。但是，在日常檢驗工作中按照GB 8538—2016方法和GB 7918.4—1987方法檢測得到的部分陽性菌株在采用VITEK 2 Compact系統(tǒng)進行鑒定時會有一定概率呈現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，從而會對實際生產(chǎn)中的水質(zhì)鑒定結(jié)論產(chǎn)生誤導。推測其原因在于部分樣品中的陽性菌株在培養(yǎng)過程中因其細胞代謝產(chǎn)物理化性質(zhì)的差異導致了VITEK 2 Compact系統(tǒng)中個別生化顯色反應(yīng)的變化從而導致系統(tǒng)的誤判。因此，在采用VITEK 2 Compact系統(tǒng)進行鑒定時，使用快速有效的特異性顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照以減少假陽性或假陰性誤差是十分必要的。

此外，基質(zhì)輔助激光電離解析飛行時間質(zhì)普（MALDI-TOF MS）因其對致病菌識別速度快等優(yōu)勢也在微生物檢測領(lǐng)域得到了推廣應(yīng)用。崔學文等[23]應(yīng)用MALDI TOF MS對不同來源的15株銅綠假單胞菌及8株干擾菌進行鑒定，所得鑒定結(jié)果于VITEK完全一致。李進等[24]利用MALDI TOF MS對VIM型和SPM型金屬酶銅綠假單胞菌進行檢測分析，MALDI-TOF MS對25株VIM型菌株靈敏度為92.0%，對于20株SPM型菌株靈敏度為80.0%，所得結(jié)果比常規(guī)PCR技術(shù)更有優(yōu)勢。但是，由于MALDI-TOF MS具有極高的靈敏度，為避免試驗誤差影響，對于試驗所用的耗材、標準溶劑以及試驗器具的質(zhì)量要求較高。同時，由于該檢測需要涉及使用專業(yè)計算機軟件對所得質(zhì)量圖譜與標準菌株圖譜庫進行比對鑒定和各種數(shù)據(jù)的聚類分析，因此對于檢測人員的技術(shù)和業(yè)務(wù)素養(yǎng)要求也較高。再加之整套系統(tǒng)的設(shè)備成本，使得該方法目前還難以在廣大的中小企業(yè)中得以普及應(yīng)用。

因此，銅綠假單胞菌顯色培養(yǎng)基（RAPID’s P.aeruginosa Agar）憑借其典型的菌落特征以及較短的增菌時間，將該培養(yǎng)基與VITEK 2 Compact系統(tǒng)結(jié)合使用可有效提高檢測效率、準確率、特異性及時效性，適用于對大批量樣品進行快速判定。但考慮到本研究所采用的試驗檢測樣本來源和數(shù)量的局限性，這一方法還需通過后續(xù)對大量實際樣本的檢測應(yīng)用來積累數(shù)據(jù)，以期為我國的飲用水安全保障事業(yè)提供技術(shù)支持。