PB實驗及響應(yīng)面法優(yōu)化山刺玫果總黃酮的提取工藝

侯少平，侯敏娜，周 蕊

(陜西國際商貿(mào)學院，陜西 西安 712046)

山刺玫(RosadavuricaPall.)，又名野玫瑰，是薔薇科薔薇屬的一種落葉小灌木，生長于樹林邊緣，該植物耐旱，可在瘠薄區(qū)域生長，主要分布在東北地區(qū)(小興安嶺以南)[1-2]。山刺玫果具有健運脾氣、調(diào)理月經(jīng)、消食、斂肺止咳的功效，對胃積食、動脈粥樣硬化、腹痛、月經(jīng)不調(diào)、肺咳都有療效[3]。山刺玫果具有很高的營養(yǎng)價值，可直接加工成果醬類食品，也是保健品以及功能性飲品的原料[4]。

目前，關(guān)于薔薇屬植物刺玫果的研究較多，而針對山刺玫果的研究較少。山刺玫果與刺玫果屬同類不同品種的植物果實，其作為鄂倫春族民族用藥，同樣具有較顯著的藥理作用。鑒于此，作者采取Plackett-Burman(PB)實驗結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化山刺玫果總黃酮的超聲輔助提取工藝，為山刺玫果的開發(fā)應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

山刺玫干燥成熟果實，由西安交通大學醫(yī)學部藥學院天然藥物化學實驗室提供。

蘆丁標椎品(批號：20140331)，上海源葉生物科技有限公司；抗壞血酸、甲醇、乙醇、乙酸乙酯，均為分析純；實驗用水為蒸餾水。

TU-1810型紫外分光光度計，北京普析儀器有限責任公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，鄭州賽特利斯；RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義瑞力儀器設(shè)備有限公司；5～50 μL移液器，中國大龍；100～1 000 μL移液器，美國Thermo Fisher；DZF-6021型真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；SQP型萬分之一天平，北京賽多利斯；800Y型粉碎機，皇代；YP202N型電子天平，上海精科。

1.2 蘆丁標準溶液的配制

精密稱取蘆丁標準品5.0 mg，105 ℃下干燥至恒重，加甲醇溶解并定容至50 mL，搖勻，即得濃度為0.1 mg·mL-1的蘆丁標準溶液[5-6]。

1.3 蘆丁標準曲線的繪制

分別精密吸取蘆丁標準溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，采用NaNO2-Al(NO3)3法測定510 nm處吸光度，以蘆丁濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線(圖1)，擬合得線性回歸方程為：A=9.9364c+0.0039，R2=0.9996，表明蘆丁濃度在0.01～0.05 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好[5]。

圖1 蘆丁的標準曲線

1.4 提取液中總黃酮得率的測定

取山刺玫干果粉50 g，在相應(yīng)條件下提取。提取液經(jīng)過濾后蒸干，取定量干膏用少量一定濃度乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，稀釋至刻度；精密量取1 mL提取液稀釋液，采用NaNO2-Al(NO3)3法測定510 nm處吸光度，根據(jù)標準曲線方程計算總黃酮含量，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)計算山刺玫果總黃酮得率(mg·g-1)[7]。

1.5 山刺玫果總黃酮提取工藝的優(yōu)化

1.5.1 最陡爬坡實驗[8-9]

影響山刺玫果總黃酮的提取因素包括提取功率、提取次數(shù)、提取時間、提取溫度、料液比、乙醇濃度、pH值等。通過查閱文獻，結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果初步確定各影響因素的取值范圍，再通過最陡爬坡實驗找到實驗頂點(最大響應(yīng)值)即為因素的+1點，根據(jù)1.25倍原則得出-1點，即確定各因素的最佳取值范圍。

1.5.2 PB實驗

使用Minitab 16軟件設(shè)計3個中心點和12組實驗，每組實驗重復3次，結(jié)果取平均值。

1.5.3 響應(yīng)面實驗

在PB實驗的基礎(chǔ)上，選取P值<0.05的因素作為響應(yīng)面實驗的設(shè)計因素，采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面實驗，確定山刺玫果總黃酮的最佳提取工藝。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert V8.0.6軟件、Minitab 16軟件和Excel 2010繪制圖表進行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 PB實驗結(jié)果

經(jīng)預(yù)實驗確定影響總黃酮得率的7個影響因素的取值范圍：提取次數(shù)為1～6次、提取液pH值為2.0～5.0、料液比為1∶(6～16)、提取功率為100～200 W、提取溫度為10～80 ℃、乙醇濃度為20%～100%、提取時間為10～60 min，共設(shè)計6組實驗，結(jié)果見表1。

表1 最陡爬坡實驗設(shè)計與結(jié)果

從表1可以看出，第4組山刺玫果總黃酮得率最高。因此，選擇第4組作為實驗頂點(+1)，根據(jù)1.25倍原則得出各因素的另一水平點(-1)，PB實驗的因素與水平見表2，PB實驗設(shè)計與結(jié)果見表3，PB實驗的方差分析見表4。

表2 PB實驗的因素與水平

表3 PB實驗設(shè)計與結(jié)果

表4 PB實驗的方差分析

對表3數(shù)據(jù)進行擬合，在雙因素交互作用不明顯的前提下評估其主效應(yīng)下的7個因素，得到其回歸方程為：Y=8.6275-0.1242X1-0.2308X2+ 0.0242X3+ 0.8208X4+ 0.3608X5-0.1908X6+ 0.0858X7。

2.2 響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

響應(yīng)面實驗的因素與水平見表5，響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果見表6，響應(yīng)面實驗的方差分析見表7。

表5 響應(yīng)面實驗的因素與水平

表6 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

表7 響應(yīng)面實驗的方差分析

響應(yīng)面設(shè)計采用5個中心點，29組實驗來進行，重點考察各因素及因素之間的交互作用對山刺玫果總黃酮得率的影響，該模型的回歸方程為：Y=10.26+0.92A+0.36B-0.19C+0.22D+0.060AB+0.20AC+0.065AD-0.60BC+0.25BD-0.26CD-1.16A2-0.81B2-0.71C2-0.81D2。

2.2.2 各因素交互作用對山刺玫果總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖(圖2)

圖2 各因素交互作用對山刺玫果總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

從圖2a可知，從等高線的形狀來看，其橢圓程度不大，說明提取功率與提取溫度的交互作用較弱；從曲面彎曲程度來看，提取功率的響應(yīng)值曲面彎曲程度大，提取溫度的響應(yīng)值曲面則較為平緩，說明提取功率較提取溫度對響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素數(shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢，截取山刺玫果總黃酮得率值最大點兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳提取功率取值范圍在136～152 W、提取溫度取值范圍在45～55 ℃。

從圖2b可知，從等高線的形狀來看，其橢圓程度不大，說明提取功率與提取液pH值的交互作用較弱；從等高線的疏密程度來看，靠近提取功率的等高線較靠近提取液pH值的等高線密集，則表明提取功率比提取液pH值對山刺玫果總黃酮得率的影響大；從曲面彎曲程度來看，提取功率的響應(yīng)值曲面圖彎曲程度大，提取液pH值的響應(yīng)值曲面則較為平緩，說明提取功率較提取液pH值對響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素數(shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢，截取距山刺玫果總黃酮得率值最大點較近兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳提取功率取值范圍在136～152 W、提取液pH值取值范圍在3.40～3.60。

從圖2c可知，從等高線的形狀來看，其橢圓程度不大，說明提取功率與乙醇濃度的交互作用較弱；從等高線的疏密程度來看，靠近提取功率的等高線較靠近乙醇濃度的等高線密集，表明提取功率比乙醇濃度對山刺玫果總黃酮得率的影響大；從曲面彎曲程度來看，提取功率的響應(yīng)值曲面彎曲程度大，乙醇濃度的響應(yīng)值曲面則較為平緩，說明提取功率較乙醇濃度對響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素數(shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢，截取距離山刺玫果總黃酮得率值最大點最近兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳提取功率取值范圍在136～152 W、乙醇濃度取值范圍在55%～65%。

從圖2d可知，從等高線的形狀來看，呈橢圓形，說明提取溫度與提取液pH值的交互作用較強；從等高線的疏密程度來看，靠近提取溫度的等高線較靠近提取液pH值的等高線密集，表明提取溫度比提取液pH值對山刺玫果總黃酮得率的影響大；從曲面彎曲程度來看，提取溫度的響應(yīng)值曲面彎曲程度大，提取液pH值的響應(yīng)值曲面則較為平緩，說明提取溫度較提取液pH值對響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素數(shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢，截取山刺玫果總黃酮得率值最大點兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳提取液pH值取值范圍在3.40～3.80、提取溫度取值范圍在50～60 ℃。

從圖2e可知，從等高線的形狀來看，其橢圓程度不大，說明提取液pH值與乙醇濃度的交互作用較弱；從等高線的疏密程度來看，靠近乙醇濃度的等高線較靠近提取液pH值的等高線密集，則表明乙醇濃度比提取液pH值對山刺玫果總黃酮得率的影響大；從曲面彎曲程度來看，乙醇濃度的響應(yīng)值曲面彎曲程度大，提取液pH值的響應(yīng)值曲面則較為平緩，說明乙醇濃度較提取液pH值對響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素數(shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢，截取距離山刺玫果總黃酮得率值最大點最近兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳乙醇濃度取值范圍在55%～65%、提取液pH值取值范圍在3.40～3.60。

從圖2f可知，從等高線的形狀來看，其橢圓程度不大，說明提取溫度與乙醇濃度的交互作用較弱；從等高線的疏密程度來看，靠近提取溫度的等高線較靠近乙醇濃度的等高線密集，則表明提取溫度比乙醇濃度對山刺玫果總黃酮得率的影響大；從曲面彎曲程度來看，提取溫度的響應(yīng)值曲面彎曲程度大，乙醇濃度的響應(yīng)值曲面表現(xiàn)則較為平緩，說明提取溫度較乙醇濃度對響應(yīng)面值影響顯著，隨兩因素數(shù)值的增大，山刺玫果總黃酮得率均呈先增大后減小的趨勢，截取山刺玫果總黃酮得率值最大點最近兩端的片段數(shù)據(jù)，可以初步確定最佳乙醇濃度取值范圍為55%～65%，提取溫度取值范圍在45～55 ℃。

2.2.3 最佳工藝的確定及驗證實驗

基于以上分析，確定山刺玫果總黃酮的最佳提取工藝為：提取功率148.09 W、提取溫度52.06 ℃、提取液pH值3.47、乙醇濃度62.38%，在此條件下，預(yù)測總黃酮得率為10.599 6 mg·g-1。根據(jù)實際可操作性原則，將最佳提取工藝優(yōu)化為：提取功率150 W、提取溫度55 ℃、提取液pH值3.5、乙醇濃度60%。在最佳提取工藝條件下進行3組平行實驗，得到山刺玫果總黃酮得率分別為10.72 mg·g-1、10.98 mg·g-1、10.20 mg·g-1，平均值為10.63 mg·g-1，與預(yù)測值相差0.03 mg·g-1，說明工藝數(shù)據(jù)可靠，該模型具有比較好的實驗預(yù)測性。

3 結(jié)論

通過PB實驗和響應(yīng)面法對山刺玫果總黃酮的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化，確定最佳提取工藝為：提取功率150 W、提取溫度55 ℃、提取液pH值3.5、乙醇濃度60%。在此條件下，山刺玫果總黃酮得率為10.63 mg·g-1。本研究先確定影響山刺玫果總黃酮的各個因素的最佳取值范圍，然后進行最陡爬坡實驗及PB實驗，選取顯著因素再進行Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面實驗，避免因響應(yīng)面法中影響因素選取不當而造成交互作用不明顯等現(xiàn)象。