鼠李糖乳桿菌MS1對(duì)副溶血弧菌群體感應(yīng)淬滅作用的研究

上官文丹，陳松，韓翔鵬，劉丹，李堯，鐘青萍

(廣東省食品質(zhì)量與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種嗜鹽性病原菌，廣泛分布于河口和海洋環(huán)境中，在魚、貝、蝦、蟹等海產(chǎn)品及腌漬食品中?？砂l(fā)現(xiàn)，能引起急性腸胃炎、敗血癥、傷口感染甚至死亡[1]。生物被膜是指細(xì)菌聚集黏附于生物或非生物表面后，通過生長(zhǎng)繁殖及分泌胞外聚合物(DNA、蛋白質(zhì)和胞外多糖等)，將自身包裹在其中形成的具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的成膜狀聚合體[2]。副溶血弧菌能以生物被膜形式存在，為菌體生長(zhǎng)提供天然保護(hù)屏障，增強(qiáng)膜內(nèi)細(xì)菌抵抗外界不利環(huán)境、產(chǎn)生耐藥性并導(dǎo)致持續(xù)性污染和感染[3]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌是西班牙、美國(guó)、日本及世界多地導(dǎo)致海鮮相關(guān)腸胃炎的主要病因[4]；而在國(guó)內(nèi)，中國(guó)東海岸近些年共爆發(fā)與食源性致病菌相關(guān)的802病例中，約40.1%是由副溶血弧菌引起[5]。副溶血弧菌已成為威脅人類健康的主要食源性致病菌之一。

群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)是細(xì)菌之間借助信號(hào)分子進(jìn)行通訊，使大量的細(xì)菌隨著種群密度和物種組成變化同步調(diào)控自身特定基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)改變生物學(xué)行為的一種現(xiàn)象[6]。研究表明，副溶血弧菌形成生物被膜及表達(dá)毒力因子等生理過程受到QS系統(tǒng)的調(diào)控。蔣富鳳等[7]發(fā)現(xiàn)，受LuxM和LuxS基因調(diào)控的OpaR和AphA基因是副溶血弧菌QS系統(tǒng)級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制中的2個(gè)核心調(diào)控子，與其運(yùn)動(dòng)性、生物被膜形成和毒力有關(guān)。李燦[8]和GUO等[9]均發(fā)現(xiàn)，在敲除調(diào)控副溶血弧菌合成QS信號(hào)分子的LuxM和LuxS基因后，其生長(zhǎng)、溶血活性、tdh毒力基因表達(dá)以及生物被膜形成均受到不同程度影響。

QS抑制劑(QS inhibitors，QSIs)是具有QS淬滅作用的一類物質(zhì)，不同的QSIs通過不同的方式來干擾細(xì)菌QS過程，如抑制QS信號(hào)分子的生物合成，降解信號(hào)分子，與信號(hào)分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體位點(diǎn)，以及結(jié)合以清除信號(hào)分子等[10]。乳酸菌分布廣，種類多，屬于公認(rèn)安全性(generally recognized as safe，GRAS)菌，目前已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中[11]。從乳酸菌中挖掘QSIs更不失為一種安全、高效的方式，目前乳酸菌源QSIs正引起學(xué)者們的關(guān)注，研究取得了一定的進(jìn)展，如海洋源戊糖片球菌zy-B-1乙酸乙酯提取物能抑制單增李斯特的AI-2活性和生物被膜形成，具有良好的QSIs活性[12]。林洋等[13]從傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中得到1株植物乳桿菌SCT-2，能通過QS抑制嗜水氣單胞菌生物被膜的形成，并降低其蛋白酶和嗜鐵素的分泌量。本研究以副溶血弧菌QS系統(tǒng)為靶標(biāo)，篩選出對(duì)其QS信號(hào)分子AI-2活性具有較強(qiáng)淬滅作用的鼠李糖乳桿菌MS1菌株，評(píng)價(jià)該菌株控制副溶血弧菌QS和生物被膜形成的效果，為開發(fā)一種綠色、安全、高效的乳酸菌源QSIs提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

16株乳酸菌(包括菌株DF1、DF2、DF4、DF5、DF6、DF9、DF12、DF14、DF15、DF16、L14、L15、L17、GK3、CG2和MS1)均為本實(shí)驗(yàn)室從發(fā)酵奶豆腐和發(fā)酵果汁中分離；哈維氏弧菌BB170和副溶血弧菌ATCC 17802，廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

TSB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨15，大豆蛋白胨5，NaCl 30，pH 7.2。121 ℃滅菌15 min。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，牛肉膏5，酵母粉4，葡萄糖20，磷酸氫二鉀1.52，乙酸鈉3.53，檸檬酸三銨2，硫酸鎂0.2，硫酸錳0.038， 吐溫-80 1.0 mL，pH 6.0。121 ℃滅菌15 min。

AB培養(yǎng)基(g/L)：硫酸鎂12.3，NaCl 17.5，酸水解酪蛋白(不含維生素)2，用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH 7.5。121 ℃滅菌15 min后添加無菌的10 mL 1 mol/L磷酸氫二鉀溶液(pH 7.5)及10 mL 0.1 mol/LL-精氨酸(pH 7.5)，20 mL 50%甘油。以上所用試劑均為市售的分析純或化學(xué)純?cè)噭?/p>

結(jié)晶紫，天津福晨公司；乙酸乙酯，天津富宇公司；PI染料、PBS緩沖液，上海生工公司；FITC-ConA染料，Sigma公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

PL602-S電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；YXQ-LS-50A全自動(dòng)高壓滅菌鍋，上海博訊公司；150A生化培養(yǎng)箱，江蘇榮華公司；TS-200B恒溫?fù)u床，上海天呈公司；5417R超高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；1285生物安全柜，美國(guó)Thermo公司；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；梯度PCR儀，日本Takara公司；R1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司；光學(xué)顯微鏡，麥克Motic公司；EVO MA 15場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡，美國(guó)FEI公司；LSM 7810 DUO and LSM 7 Live激光共聚焦顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化

乳酸菌接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h；副溶血弧菌接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h；哈維氏弧菌BB170接種于AB培養(yǎng)基中，30 ℃、90 r/min培養(yǎng)12 h。所有菌株均活化2代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 乳酸菌乙酸乙酯提取物的制備

將活化的乳酸菌接于MRS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，用0.45 μm微孔濾膜過濾獲得乳酸菌發(fā)酵上清液。將上清液與乙酸乙酯等比例加入分液漏斗，振蕩萃取，靜置過夜。待分層后，收集乳化層，于37 ℃、120 r/min進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去乙酸乙酯。收集濃縮液，真空冷凍干燥成粉末(干燥器中保存)。實(shí)驗(yàn)前將提取物溶于TSB或AB培養(yǎng)基，過濾除菌，配制成質(zhì)量濃度為50 mg/mL工作液，備用。

1.2.3 副溶血弧菌QSIs的篩選

采用哈維氏弧菌BB170生物發(fā)光法[14]測(cè)定經(jīng)過不同的乳酸菌源QSIs處理的副溶血弧菌的AI-2活性，以篩選乳酸菌源QSIs。將活化的副溶血弧菌接種于含2 mg/mL 乳酸菌源QSIs的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min 培養(yǎng)12 h。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集、過濾獲得無菌上清液，備用?；罨蟮墓S氏弧菌BB170接種于AB培養(yǎng)基，30 ℃、90 r/min培養(yǎng)12 h，調(diào)節(jié)菌液OD595nm為0.8左右，再用無菌新鮮AB培養(yǎng)基按1∶5 000稀釋該菌液，混勻備用。按1∶50體積比將上述收集的上清液與哈維氏弧菌BB170稀釋菌懸液混合。30 ℃、100 r/min搖瓶培養(yǎng)3 h，避光條件下吸取200 μL于黑色不透明酶標(biāo)板中，以多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)哈維氏弧菌BB170發(fā)光情況，以MS1-QSI未處理的副溶血弧菌為對(duì)照組。計(jì)算乳酸菌QSIs對(duì)副溶血弧菌AI-2活性的抑制率如公式(1)所示：

(1)

1.2.4 MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌和哈維氏弧菌生長(zhǎng)曲線的影響

采用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線儀進(jìn)行測(cè)定。在100微型孔板孔內(nèi)分別加入200 μL含MS1-QSI質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL 的TSB或AB培養(yǎng)基，以未含MS1-QSI的TSB或AB培養(yǎng)基為對(duì)照組。將活化的副溶血弧菌或哈維氏弧菌接種于孔內(nèi)。37 ℃或30 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h測(cè)定OD600nm值。

1.2.5 MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌群集和泳動(dòng)的抑制

按照SANTHAKUMARI等[15]的方法進(jìn)行并稍作修改。取2 μL上述1.2.5中培養(yǎng)前的含不同質(zhì)量濃度MS1-QSI的副溶血弧菌菌懸液接于群集平板(1%蛋白胨、3% NaCl、0.5%瓊脂和0.5%葡萄糖，pH 7.2)和泳動(dòng)平板(1%胰蛋白胨、3% NaCl和0.3%瓊脂，pH 7.2)中央，以未加MS1-QSI作為空白對(duì)照組。37 ℃正置培養(yǎng)24 h，觀察2種培養(yǎng)基上副溶血弧菌遷移直徑的變化，計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：dControl為空白對(duì)照組副溶血弧菌群集或泳動(dòng)的遷移直徑，mm；dQSIs為MS1-QSI處理組副溶血弧菌群集或泳動(dòng)的遷移直徑，mm。

1.2.6 MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌AI-2信號(hào)分子活性影響

副溶血弧菌菌懸液加入含MS1-QSI質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.8 mg/mL的TSB培養(yǎng)基(菌的終濃度為107CFU/mL)，混勻，于37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h后，離心、過濾收集上清液。按照1.2.3方法測(cè)定AI-2活性。

1.2.7 MS1-QSI對(duì)胞外多糖(extracellular polysaccharides，EPS)生成的影響

按照NITHYA等[16]的方法進(jìn)行。在48孔板孔內(nèi)加入1 mL含MS1-QSI質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.8 mg/mL的TSB培養(yǎng)基，副溶血弧菌菌懸液接種于孔內(nèi)(菌的終濃度為107CFU/mL)，每孔放入無菌蓋玻片，37 ℃溫育24 h。將培養(yǎng)后的蓋玻片放入含0.5 mL生理鹽水試管中，充分振蕩洗脫30 s后，加入0.5 mL 5%(體積分?jǐn)?shù))苯酚，立即振勻并加入2.5 mL濃H2SO4，振蕩后測(cè)定OD490nm。抑制率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：ODControl指空白對(duì)照組測(cè)得的EPS的OD490nm值；ODQSIs指MS1-QSI處理后測(cè)得的EPS的OD490nm值。

1.2.8 MS1-QSI對(duì)生物被膜生物量的影響

采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物被膜的生物量。在96板孔內(nèi)加入200 μL含MS1-QSI質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.8 mg/mL的TSB培養(yǎng)基，副溶血弧菌菌懸液接種于孔內(nèi)(菌的終濃度為107CFU/mL)，37 ℃培養(yǎng)24 h；移除孔內(nèi)浮游菌，用PBS緩沖液輕緩清洗2～3次，60 ℃干燥固定30 min；加入0.1%結(jié)晶紫染色5 min，用PBS緩沖液輕緩清洗3次，干燥；加入33%冰乙酸脫色10 min，測(cè)定OD595nm值。

1.2.9 光學(xué)顯微鏡觀察

在24孔板中分別加入1.5 mL含MS1-QSI質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的TSB培養(yǎng)基，副溶血弧菌菌懸液接種于培養(yǎng)基中(菌的終濃度為107CFU/mL)，每孔中放置無菌蓋玻片，37 ℃培養(yǎng)24 h。以未加入MS1-QSI處理的作為空白對(duì)照組；用超純水輕緩潤(rùn)洗玻片，去除浮游狀態(tài)菌；以結(jié)晶紫染色5 min，棄染色液，用PBS緩沖液緩慢清洗玻片，室溫下晾干；用光學(xué)顯微鏡的油鏡觀察。

1.2.10 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(field emission scanning electron microscope，F(xiàn)ESEM)觀察

將1.2.8獲得的生物被膜標(biāo)本片，用PBS緩沖液輕緩潤(rùn)洗3次，加入2.5%戊二醛溶液，4 ℃固定24 h；用PBS緩沖液輕緩清洗3次，加入1%鋨酸固定0.5 h；用PBS緩沖液輕緩清洗3次，用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%乙醇各脫水10 min，最后用100%乙醇脫水2次，每次10 min；蓋玻片真空干燥后噴金，掃描電鏡下觀察生物被膜。

1.2.11 激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)觀察

將1.2.8獲得的生物被膜標(biāo)本片，用PBS緩沖液輕緩洗去玻片上的浮游菌，加入5 μL FITC Con-A染色液，4 ℃低溫染色30 min；加入5 μL PI染料，低溫染色15 min。上述染色和制片操作均在避光條件下進(jìn)行。使用CLSM觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，取其平均值，結(jié)果采用Graphpad prism 7.0作圖，采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌源QSIs的篩選

圖1顯示，16株乳酸菌乙酸乙酯提取物對(duì)副溶血弧菌AI-2信號(hào)分子存在不同程度的抑制作用，抑制率為7.74%～69.54%；菌株DF1、DF4、DF5、L14、GK3、CG2、MS1對(duì)副溶血弧菌AI-2活性抑制率超過50%，可作為潛在的副溶血弧菌QSIs，其中鼠李糖乳桿菌MS1乙酸乙酯提取物抑制率達(dá)69.54%，將該提取物命名為MS1-QSI，進(jìn)一步研究其對(duì)副溶血弧菌的抑制效果。

圖1 乳酸菌菌株的乙酸乙酯提取物對(duì)副溶血弧菌AI-2活性的影響Fig.1 Effects of the ethyl acetate extracts of different strains of lactic acid bacteria on AI-2 activity of V.parahaemolyticus注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌和哈維氏弧菌生長(zhǎng)的影響

圖2-A表明，隨著MS1-QSI濃度的增加，對(duì)副溶血弧菌生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量依賴性；圖2-B表明，MS1-QSI在添加質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對(duì)哈維氏弧菌的生長(zhǎng)基本不產(chǎn)生影響。為證明菌株MS1是通過抑制副溶血弧菌QS而非抑菌發(fā)揮作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇0.8 mg/mL及以下質(zhì)量濃度的MS1-QSI進(jìn)行。

A-副溶血弧菌；B-哈維氏弧菌圖2 MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌和哈維氏弧菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of MS1-QSI on the growths of V.parahaemolyticus and V.harveyi

2.3 MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌群集和泳動(dòng)能力的影響

群集和泳動(dòng)是副溶血弧菌的主要運(yùn)動(dòng)方式，副溶血弧菌依賴鞭毛運(yùn)動(dòng)有利于增強(qiáng)生物被膜的形成，增加對(duì)海鮮食品的污染能力及對(duì)宿主的致病性[17]。由圖3可知，添加MS1-QSI后的致病菌運(yùn)動(dòng)范圍明顯縮小，且呈現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用。在群集平板中，對(duì)照組的群集直徑為(14.11±1.75) mm，添加0.8 mg/mL的MS1-QSI使細(xì)菌群集范圍縮小至(6.68±0.34) mm，抑制率達(dá)52.67%；在泳動(dòng)平板中，對(duì)照組的遷移范圍靠近皿底邊緣，遷移直徑達(dá)(89.59±0.15) mm，表明副溶血弧菌的泳動(dòng)能力強(qiáng)；添加0.8 mg/mL的MS1-QSI可使遷移直徑降低至(43.49±1.13) mm，抑制率達(dá)51.45%。

1～4-MS1-QSI添加質(zhì)量濃度分別為0、0.2、0.4、0.8 mg/mLA-副溶血弧菌群集；B-副溶血弧菌泳動(dòng)圖3 MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌群集和泳動(dòng)的抑制作用Fig.3 Inhibitory activities of MS1-QSI on swarming and swimming of V.parahaemolyticu

2.4 MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌群體感應(yīng)AI-2活性、EPS合成和生物被膜形成的影響

AI-2型QS系統(tǒng)能調(diào)控副溶血弧菌生物被膜的形成。EPS是維持生物被膜復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的主要基質(zhì)成分，能抵抗外界環(huán)境抗菌物質(zhì)的擴(kuò)散，誘導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)菌耐藥性。圖4顯示，MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌AI-2活性、EPS合成和生物被膜形成的抑制作用隨質(zhì)量濃度的增大而顯著增加(P<0.05)。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 時(shí)，MS1-QSI對(duì)AI-2活性、EPS合成和生物被膜形成的抑制率分別達(dá)65.27%、65.54%、86.91%。結(jié)果表明，MS1-QSI可有效抑制副溶血弧菌的AI-2活性及EPS合成，從而抑制生物被膜形成。

圖4 MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌AI-2活性、EPS合成和生物被膜形成的影響Fig.4 Effect of MS1-QSI on AI-2 activity, EPS synthesis and biofilm formation of V.parahaemolyticuss

2.5 光學(xué)顯微鏡和FESEM觀察生物被膜的變化

圖5為光學(xué)顯微鏡和FESEM觀察MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌生物被膜的影響。在光學(xué)顯微鏡下，對(duì)照組中的副溶血弧菌菌落出現(xiàn)聚集，菌體間緊密聯(lián)結(jié)，處理組的細(xì)菌分布明顯稀疏。FESEM觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的副溶血弧菌聚集成團(tuán)狀，形成具有明顯空間特征的生物被膜，而處理后的細(xì)菌則散落分布在視野中。結(jié)果表明MS1-QSI能有效阻止副溶血弧菌的相互聚集，抑制細(xì)菌聚集體的形成從而抑制生物被膜形成。

A-光學(xué)顯微鏡(1 000×)；B-FESEM(3 500×)圖5 光學(xué)顯微鏡和FESEM觀察MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌生物被膜的影響Fig.5 Observation of the biofilm of V.parahaemolyticus treated by MS1-QSI under light microscope and FESEM

2.6 CLSM觀察生物被膜的變化

熒光染料結(jié)合CLSM顯像技術(shù)可觀察生物被膜結(jié)構(gòu)和厚度情況[18]。如圖6所示，對(duì)照組中的副溶血弧菌菌體連接致密，分泌大量EPS將自身包裹其中，生物被膜結(jié)構(gòu)完整，具有一定厚度；處理組中的細(xì)菌疏散，生物被膜的熒光強(qiáng)度明顯減弱，表明細(xì)菌分泌的EPS顯著減少，生物被膜較對(duì)照組稀薄。

1～3-CLSM觀察下生物被膜的明場(chǎng)、平面及其熒光強(qiáng)度圖A-對(duì)照組；B-處理組圖6 CLSM觀察MS1-QSI對(duì)副溶血弧菌生物被膜的影響Fig.6 Effect of MS1-QSI on the biofilm of V.parahaemolyticus

3 討論

AI-2型QS系統(tǒng)參與微生物的多種重要生化過程，是近年來研究的熱點(diǎn)，例如LuxS/ AI-2系統(tǒng)不僅介導(dǎo)銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)發(fā)育、生物被膜形成和致病性[19]，也可通過調(diào)節(jié)外排泵SatAB基因參與豬鏈球菌對(duì)氟喹諾酮類抗生素的敏感性[20]，還能調(diào)控肺炎球菌生物被膜與毒力等相關(guān)基因的表達(dá)[21]。以QS為靶標(biāo)干擾細(xì)菌不引起細(xì)菌的耐藥性，對(duì)控制食品腐敗變質(zhì)和食物中毒，保障食品安全具有重要意義。目前，基于QS淬滅機(jī)制的微生物源QSIs研究取得了一定進(jìn)展，但目標(biāo)菌多集中于銅綠假單胞菌等致病菌，對(duì)副溶血弧菌的相關(guān)研究相對(duì)匱乏，本研究以副溶血弧菌QS系統(tǒng)為靶標(biāo)，研究對(duì)其淬滅作用較強(qiáng)的乳酸菌，對(duì)控制副溶血弧菌的危害，以及拓寬乳酸菌的研究和應(yīng)用領(lǐng)域，尋找新的食品防腐保鮮措施具有積極的意義。

本研究采用哈維氏弧菌BB170生物發(fā)光法篩選得到對(duì)副溶血弧菌群體感應(yīng)AI-2活性抑制作用強(qiáng)的乳酸菌，并從細(xì)菌生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、EPS產(chǎn)生以及生物被膜形成4個(gè)方面探究其對(duì)副溶血弧菌QS的淬滅作用。鞭毛運(yùn)動(dòng)不僅介導(dǎo)細(xì)菌在物體表面上的初始黏附，參與、維持生物被膜空間立體結(jié)構(gòu)，也有利于細(xì)菌從成熟生物被膜中脫離并發(fā)生再黏附過程[2]。鞭毛突變體的單增李斯特菌顯著降低了在玻璃表面的黏附能力，形成有缺陷的生物被膜[22]；ENOS-BERLAG等[23]把副溶血弧菌鞭毛基因flgE和flgD敲除后，細(xì)菌的生物被膜形成能力減弱，不產(chǎn)生成熟生物被膜，說明鞭毛是生物被膜形成過程中的重要決定因子。MS1-QSI在不影響副溶血弧菌正常生長(zhǎng)前提下，能有效阻止由副溶血弧菌鞭毛主導(dǎo)的群集和泳動(dòng)現(xiàn)象，這與其他乳酸菌源QSIs能通過QS系統(tǒng)抑制嗜水氣單胞菌[24]、單增李斯特菌[12]的鞭毛運(yùn)動(dòng)結(jié)果相類似。EPS具有黏液性，能使細(xì)胞聚集并相互連接，從而在物體表面形成三維生物被膜結(jié)構(gòu)[25]。GUVENER等[26]研究發(fā)現(xiàn)多糖合成基因(cpsA)受到群體感應(yīng)調(diào)節(jié)因子OpaR的調(diào)控。本文研究表明MS1-QSI能顯著降低副溶血弧菌AI-2活性、干擾副溶血弧菌QS系統(tǒng)， 影響其鞭毛運(yùn)動(dòng)、EPS合成和生物被膜形成能力。鼠李糖乳桿菌MS1具有良好的QS淬滅活性，有望成為控制副溶血弧菌感染和致病性的新型生物制劑，其調(diào)控副溶血弧菌QS、生物被膜形成的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。