馬鈴薯莖段和葉片再生體系建立

張冬梅，修志君，馮亞艷，楊春芳，王麗瑋，劉 潔，張笑宇

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2.包頭市園林綠化事業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古 包頭 014000）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是一年生草本植物，是僅次于水稻、小麥、玉米的第四大糧食作物［1］.我國(guó)作為世界馬鈴薯生產(chǎn)第一大國(guó)，隨著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，急需特色、優(yōu)質(zhì)的新品種［2］.傳統(tǒng)育種方法，很難達(dá)到產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性的大幅度提高［3］，以改良基因、創(chuàng)造新品種為戰(zhàn)略目標(biāo)的植物基因工程技術(shù)越來(lái)越受重視，使馬鈴薯基因的遺傳改良和育種工作取得質(zhì)的飛躍，為培育馬鈴薯新品種提供了可能［4-5］.

植物基因工程中，組織培養(yǎng)再生是遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立、突變體的篩選、優(yōu)良種苗的快速繁殖及體細(xì)胞雜交等技術(shù)的前提和基礎(chǔ)［5］.馬鈴薯再生體系要經(jīng)過(guò)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化過(guò)程，易受基因型［6-7］、外植體種類(lèi)［8］、植物激素種類(lèi)及濃度［9-10］影響，同時(shí)光照時(shí)間、溫度等外界環(huán)境因素也會(huì)不同程度地影響愈傷組織形成及其再分化［11-12］.馬鈴薯組織培養(yǎng)再生是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，沒(méi)有可普遍應(yīng)用的再生體系，不同馬鈴薯品種遺傳轉(zhuǎn)化之前都要先建立相應(yīng)的再生體系［13］，再生體系對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的有效遺傳操作和獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系均具有重要的理論和實(shí)踐意義.目前存在馬鈴薯的再生誘導(dǎo)率低、質(zhì)量不穩(wěn)定、試驗(yàn)重復(fù)性差等問(wèn)題［8］，因此，對(duì)于馬鈴薯的愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系還需進(jìn)一步優(yōu)化.

筆者以大西洋脫毒試管苗為試驗(yàn)材料，對(duì)其莖段和葉片的再生體系進(jìn)行研究，篩選愈傷組織形成及芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，優(yōu)化最佳激素配方，以期獲得高效愈傷組織誘導(dǎo)率和分化率的培養(yǎng)體系，為建立大西洋再生體系和馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定理論基礎(chǔ)，為馬鈴薯的基因工程育種、品種改良、基因功能研究提供技術(shù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試馬鈴薯材料為培養(yǎng)28 d生長(zhǎng)良好的大西洋（Atlantic）脫毒試管苗，是經(jīng)莖尖剝離、病毒檢測(cè)的無(wú)毒組培苗，保存在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室.

供試培養(yǎng)基為Murashige and Skoog（MS）培養(yǎng)基：硝酸鉀（KNO3）1.9 g，硝酸銨（NH4NO3）1.65 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.17 g，硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.37 g，無(wú)水氯化鈣（CaCl2）0.332 g；碘化鉀（KI）0.008 3 g，硼酸（H3BO3）0.062 g，硫酸錳（MnSO4·4H2O）0.223 g，硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）0.086 g，鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）0.002 5 g，硫酸銅（CuSO4·5H2O）0.002 5 g，氯化鈷（CoCl2）0.000 25 g；乙二胺四乙酸二鈉0.037 3 g，硫酸亞鐵0.278 g；肌醇10 g，甘氨酸0.02 g，鹽酸硫胺素0.001 g，鹽酸吡哆醇0.005 g，煙酸VB5或VPP 0.005 g，蔗糖30 g·L-1，瓊脂8 g·L-1，蒸餾水1 000 mL，pH 5.8~6.0.

試驗(yàn)試劑：6-芐氨基嘌呤（6-BA）、α-萘乙酸（NAA）、赤霉素（GA3）均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；玉米素（ZT）購(gòu)自北京百靈威科技有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試管苗擴(kuò)繁

將帶腋芽的莖段接種于MS培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)條件為溫度23～25 ℃，光照時(shí)間為16/8 h，光照強(qiáng)度為2 000~3 000 lx.3～4周苗齡的試管苗用于試驗(yàn).

1.2.2 誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基篩選

1.2.2.1 誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基制作

配制不同濃度的激素：0.25、1.50、2.50、5.00 mg·L-16-BA和0.10、0.20、0.30、0.40 mg·L-1NAA，用無(wú)菌0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，分裝于50 mL滅菌離心管中，4 ℃保存.經(jīng)高壓滅菌后的MS培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右時(shí)，按表1中的配比加入激素，制成不同激素濃度的培養(yǎng)基.

表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基Tab. 1 Callus induction medium mg·L-1

續(xù)表1

1.2.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

無(wú)菌操作剪取0.5~1.0 cm長(zhǎng)不帶腋芽和葉片的培養(yǎng)好的大西洋脫毒試管苗莖段及切掉部分葉尖保留葉柄的健壯葉片.將莖段和葉片分別移入配制好的各種誘導(dǎo)愈傷組織形成的培養(yǎng)基中.1個(gè)培養(yǎng)皿中放置莖段20個(gè)、葉片15個(gè)，試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，按1.2.1中的培養(yǎng)條件培養(yǎng)14 d，根據(jù)愈傷組織生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率.

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的莖段或葉片/莖段或葉片總數(shù)×100%

1.2.3 不定芽分化培養(yǎng)基篩選

1.2.3.1 不定芽分化培養(yǎng)基的制備

配制不同濃度激素：1.00、2.00、3.00、5.00 mg·L-16-BA，0.05、0.10、0.20、0.30 mg·L-1NAA，0、1.00、2.00、3.00 mg·L-1ZT和0、2.50、5.00、10.00 mg·L-1GA3，用無(wú)菌0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾除菌，分裝于50 mL滅菌離心管中，4 ℃保存.經(jīng)高壓滅菌后的MS培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右時(shí)，按表2中的配比加入激素，制成不同激素濃度的芽分化培養(yǎng)基.

1.2.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將在C4（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA）和C15（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA）培養(yǎng)基中形成的莖段和葉片愈傷組織再分別移入不同激素濃度的不定芽分化培養(yǎng)基（表2）中，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，按1.2.1中的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，觀察芽分化情況，40 d統(tǒng)計(jì)芽分化率.

表2 不定芽分化培養(yǎng)基配比Tab. 2 Ratio of adventitious bud differentiation medium mg·L-1

芽分化率=分化出不定芽莖段或葉片/莖段或葉片總數(shù)×100%

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)大西洋愈傷組織形成的影響

將莖段或葉片接到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)7 d左右時(shí)，莖段兩端切口處開(kāi)始膨大變粗，并逐漸向中部擴(kuò)展；葉片切割邊緣慢慢卷曲，開(kāi)始出現(xiàn)膨大增殖現(xiàn)象，葉柄的傷口處也逐漸膨大.生長(zhǎng)至14 d左右時(shí)，葉片、葉柄及莖端切口處均會(huì)長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的愈傷組織（圖1）.

圖1 最佳培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)（14 d）Fig. 1 The best medium for callus induction culture（14 d）

不同激素配比的16 種培養(yǎng)基對(duì)莖段愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果表明，莖段在C1（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA）、C2（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA）、C3（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA）、C4（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA）、C15（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA）和C16（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA）這6種培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率均在90%以上，生長(zhǎng)量較好，淡綠色，米粒狀（表3）.通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在C3和C4培養(yǎng)基上已生根，而在其他培養(yǎng)基上則無(wú)生根.由此可知，誘導(dǎo)莖段愈傷組織最佳培養(yǎng)基為C4.

不同培養(yǎng)基對(duì)葉片愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果表明，在愈傷組織誘導(dǎo)率、組織量、顏色和形狀等方面，葉片在C2（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA）、C3（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA）和C4（MS+0.25 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA）這3個(gè)培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，均在45%以下，愈傷組織生長(zhǎng)量較差，愈傷組織呈乳白色，小突起；在C13（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA）、C15（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA）和C16（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA）培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率分別為85.93%、77.04%和80.74%，生長(zhǎng)量最好，淡綠色，米粒狀（表3）.通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然葉片在C13和C16培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率均大于C15，但在C13和C16培養(yǎng)基上無(wú)生根，而C15培養(yǎng)基上已生根.因此，葉片愈傷誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為C15.

表3 不同激素配比對(duì)大西洋莖段和葉片愈傷組織誘導(dǎo)Tab. 3 The effect of different hormone ratios on Atlantic stem and leaf callus induction

2.2 不同激素配比對(duì)大西洋愈傷組織不定芽分化的影響

將莖段和葉片愈傷組織轉(zhuǎn)到以6-BA、NAA、ZT 及GA3組合配比的16 個(gè)分化培養(yǎng)基上，觀察結(jié)果表明，生長(zhǎng)3周左右開(kāi)始形成綠色芽點(diǎn)，5周左右慢慢長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的小芽（圖2）.

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間的莖段不定芽分化Fig. 2 Adventitious bud differentiation of stem at different culture time

比較不同培養(yǎng)基上莖段愈傷組織不定芽分化率和長(zhǎng)勢(shì)，最佳培養(yǎng)基為D14（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA+10.00 mg·L-1GA3），分化率為41.11%，芽多且粗壯；其次為D5（MS+2.00 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA+5.00 mg·L-1GA3），分化率為31.11%，芽多且粗壯；其他培養(yǎng)基上的分化率較低，長(zhǎng)勢(shì)較差；在D1（1.00 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差，分化率為6.11%，芽弱?。ū?）.

比較葉片愈傷組織不定芽分化率和長(zhǎng)勢(shì)，最佳培養(yǎng)基為D14（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA+10.00 mg·L-1GA3），分化率為40.00%，芽多且肥厚；其次是D7（MS+2.00 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1ZT）和D15（MS+5.00 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1ZT）培養(yǎng)基，分化率均為30.37%；其他培養(yǎng)基較差；最差的是D1（1.00 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA）培養(yǎng)基，葉片愈傷組織基本不分化成芽，只出現(xiàn)愈傷組織增大且老化現(xiàn)象（表4）.

表4 不同激素配比對(duì)大西洋莖段和葉片不定芽誘導(dǎo)Tab. 4 Different hormone ratios on adventitious bud induction in Atlantic stem segments and leaves

總之，誘導(dǎo)莖段和葉片愈傷組織不定芽分化的最佳培養(yǎng)基均為D14，其分化率均達(dá)40%.

3 討論與結(jié)論

適宜的外植體應(yīng)具備幼年型、增殖能力強(qiáng)、再生能力強(qiáng)及遺傳穩(wěn)定性好的特點(diǎn).目前，不帶腋芽的莖段［14］、葉片［15］或試管薯［16］作為馬鈴薯外植體用于再生體系研究中，幼苗的苗齡［17］、接種方式［18］和培養(yǎng)條件［19-20］均對(duì)馬鈴薯的再生有一定影響.激素的種類(lèi)和濃度是影響馬鈴薯愈傷組織形成的關(guān)鍵因素.馬鈴薯愈傷組織形成只有在合適配比的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素類(lèi)激素的組合中才可以取得較好的誘導(dǎo)效果［21］.本試驗(yàn)中選用不同濃度的6-BA和NAA激素組合配比對(duì)莖段和葉片的愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)，莖段誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+0.25 mg·L-16-BA+0.40 mg·L-1NAA，葉片誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+5.00 mg·L-16-BA+0.30 mg·L-1NAA，其誘導(dǎo)率分別為96.67%、77.04%，愈傷組織為淡綠色，結(jié)構(gòu)較致密呈米粒狀，且均可生根，結(jié)果與張之為等［22］研究一致.不同激素濃度對(duì)愈傷組織形成有很多影響.本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，6-BA濃度為0.25 mg·L-1和5.00 mg·L-1時(shí)，莖段愈傷組織形成情況差別不大，但使用0.25 mg·L-16-BA配合0.40 mg·L-1NAA進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，會(huì)促進(jìn)莖段愈傷組織的根生長(zhǎng).楊明賀等［13］研究得出不一致的結(jié)果，認(rèn)為6-BA的最適濃度為2.00 mg·L-1，降低或者升高，莖段愈傷組織誘導(dǎo)率均大幅度下降.

不同濃度的激素對(duì)馬鈴薯莖段和葉片的愈傷組織不定芽分化存在影響.已有研究表明，GA3是提高愈傷組織不定芽分化階段的關(guān)鍵激素，可促進(jìn)莖的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞分裂和分化［23-24］.本試驗(yàn)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)莖段和葉片愈傷組織不定芽分化的最佳培養(yǎng)基均為MS+5.00 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1NAA+10.00 mg·L-1GA3，其誘導(dǎo)率均可達(dá)40%.張之為等［22］利用MS+2.00 mg·L-16-BA+0.20 mg·L-1NAA+1.00 mg·L-1ZT可使大西洋的愈傷組織分化出芽，分化率為18.18%，這和本試驗(yàn)的結(jié)論一致，不加GA3激素，適當(dāng)添加ZT激素，也會(huì)促使愈傷組織的不定芽分化.