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    清血消脂方對(duì)小鼠銀屑病合并脂代謝紊亂模型的干預(yù)作用

    2021-11-30 09:11:08張蕾李萍劉衛(wèi)紅林燕解欣然
    醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:消脂咪喹莫特

    張蕾,李萍,劉衛(wèi)紅,林燕,解欣然

    (首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院北京市中醫(yī)研究所,北京 100010)

    針對(duì)銀屑病的治療不再局限于皮膚,而需考慮系統(tǒng)性治療。其中,銀屑病合并脂代謝紊亂最為普遍,主要表現(xiàn)為總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)水平升高,高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL)組分降低[1];皮損處也表現(xiàn)為脂類代謝異常[2]。脂代謝紊亂是代謝綜合征、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ),影響疾病的發(fā)展和預(yù)后。清血消脂方是北京中醫(yī)醫(yī)院名老中醫(yī)黃麗娟教授用于治療高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的有效中藥復(fù)方,實(shí)驗(yàn)研究表明能夠降低高脂血癥動(dòng)物模型的脂代謝紊亂,抑制小鼠的代謝性炎癥反應(yīng)[3]。臨床研究也表明清血消脂方能改善患者脂代謝紊亂[4-5]。筆者采用咪喹莫特誘導(dǎo)載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)敲除小鼠模擬高脂狀態(tài)基礎(chǔ)上的銀屑病,進(jìn)行銀屑病合并脂代謝紊亂的病理機(jī)制和藥物研究[6]。本文嘗試將清血消脂方作用于咪喹莫特誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠模型,觀察其對(duì)銀屑病合并脂代謝紊亂的影響,為臨床治療銀屑病合并癥提供新的思路。

    1 材料與方法

    1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性ApoE-/-小鼠24只,28周齡;雄性C57BL/6J小鼠8只,28周齡。小鼠均購(gòu)自北京華阜康生物技術(shù)股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2014-0004。飼養(yǎng)條件為:室溫18~22 ℃,相對(duì)濕度50%~60%,晝夜12 h交替照明。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)處理均嚴(yán)格遵守美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用手冊(cè)》(NIH Publication No.85-23,1996),并遵循動(dòng)物福利原則及首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

    1.2藥物和試劑 清血消脂方(虎杖15 g、大黃10 g、蒲黃10 g、姜黃10 g、澤瀉15 g、萆薢10 g、茵陳15 g、白術(shù)12 g、石菖蒲10 g、紅花5 g),以上中藥飲片由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部提供,制備為水煎液。實(shí)驗(yàn)劑量根據(jù)臨床等效劑量換算為生藥計(jì)量22.4 g·kg-1,按10 mL·kg-1灌胃[7]。阿托伐他汀鈣片(輝瑞制藥有限公司,批號(hào):DE7888);用0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethyl cellulose,CMC)溶液配制,按10 mg·kg-1灌胃;咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào):18080439);戊巴比妥鈉(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):018K0754);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(德國(guó)Leica公司,批號(hào):120216);增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)兔單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司,批號(hào):REV08/16/16);Involucrin兔多克隆抗體、凝素樣氧化低密度脂蛋白受體-1(lectin like oxLDL receptor-1,LOX-1)兔多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司,批號(hào)分別為GRB7751-24,GR225261-17);FITC anti-mouse CD4,APC anti-mouse IFN-γ,PE anti-mouse IL-17A,Cell Stimulation Cocktail等(美國(guó)Affymetrix eBioscience公司,批號(hào)分別為2037887,193640,2023658,200547);Mouse/Rat Soluble Protein Master Buffer Kit、IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-12/IL-23p40(美國(guó)Becton,Dickinson公司,批號(hào):93746);Dupint NEN TSA-Indirect Tyramide Signal Amplification Kit (美國(guó)Dupint公司,批號(hào):1798654);TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司,批號(hào):235005);PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)、DL2000 DNA Marker[寶生物工程(大連)有限公司,批號(hào)分別為AK4102、AK5504、A2301A];引物由美國(guó)Invitrogen公司合成。

    1.3主要儀器 3-18K型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)希格瑪實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)公司);ASP6025全自動(dòng)真空組織脫水機(jī)、EG1150H石蠟包埋機(jī)、RM2255全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、全自動(dòng)染色機(jī)及Aperio CS2臺(tái)式玻片掃描儀(德國(guó)Leica公司);Cobas C601全自動(dòng)生化分析儀(瑞士羅氏公司);FACSVerse流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton,Dickinson and Company公司);LSM780激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司);ABI 7500熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);Multiskan Spectrum全波長(zhǎng)酶聯(lián)免疫測(cè)定儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)等。

    1.4動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 小鼠適應(yīng)1周后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為4組:正常對(duì)照組(C57BL/6J小鼠)、模型對(duì)照組(ApoE-/-小鼠)、清血消脂方組(ApoE-/-小鼠)和阿托伐他汀鈣組(ApoE-/-小鼠),每組8只。清血消脂方組(22.4 g·kg-1)和阿托伐他汀鈣組(10 mg·kg-1),按10 mL·kg-1灌胃給藥。3周后,全部小鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(80 mg·kg-1),背部去毛后單籠飼養(yǎng)。次日給予全部ApoE-/-小鼠均勻涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg,同時(shí)給予相應(yīng)藥物;正常對(duì)照組C57BL/6J小鼠涂抹等量凡士林,正常對(duì)照組和模型組灌胃等量純水,連續(xù)5 d。

    1.5檢測(cè)指標(biāo)和方法

    1.5.1小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度(psoriasis area and severity index,PASI)評(píng)分 每天觀察小鼠皮損情況,并采用數(shù)碼照相,依據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),給予小鼠皮損處紅斑、鱗屑及浸潤(rùn)程度(0:無(wú);1:輕度;2:中度;3:重度;4:極重度)打分,將三者積分相加得到總積分,取平均值后繪制趨勢(shì)線,觀察各組小鼠皮損的變化情況。

    1.5.2小鼠皮損組織病理學(xué)變化 將小鼠用戊巴比妥鈉注射處死后,剪取皮損處皮膚,每組3只,浸沒(méi)于10%甲醛溶液中,固定48 h;常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色,用中性樹(shù)膠封片。Leica玻片掃描儀掃描并獲取圖像(20倍),每個(gè)標(biāo)本選視野4個(gè),采用 Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測(cè)量表皮厚度。

    1.5.3小鼠皮損Involucrin、PCNA和LOX-1的表達(dá) 選取皮膚組織蠟塊,每組3只,切片,使用Dupont NEN TSA-Indirect Tyramide Signal Amplification Kit,具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行[8]。依次脫蠟、封閉、一抗孵育,抗體稀釋濃度:外皮蛋白(Involucrin)1:1500、PCNA 1:2500、LOX-1 1:1500,4 ℃孵育過(guò)夜;HRP標(biāo)記的豬抗兔IgG 室溫孵育30min;Biotinyl Tyramide室溫孵育10 min;Treptavidin fluorescence 37 ℃孵育10 min;防淬滅封片劑封片。Zeiss激光共聚焦顯微鏡下(20倍物鏡)攝像,波長(zhǎng)分別為405,490,647,550 nm,原位合并圖像。

    1.5.4小鼠血脂水平 將小鼠麻醉后眼球取血,每組8只,1123×g,離心10 min,取血清,-80℃冰箱保存。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)TC、TG、LDL、HDL水平,具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

    1.5.5小鼠脾臟Th1/Th17細(xì)胞計(jì)數(shù) 選取小鼠脾臟,每組4只,制備為單細(xì)胞懸液,加細(xì)胞混合刺激劑(PMA+Iionomysin+BFA),37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱孵育4 h;加入CD4-FITC抗體,室溫避光反應(yīng)20 min;固定后加破膜劑,加干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和 IL-17A抗體,室溫避光反應(yīng)30 min;清洗后加PBS重懸混勻進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

    1.5.6小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子水平 采用流式微珠陣列(cytometric bead array,CBA)法檢測(cè)小鼠血清中IL-17A、IL-17F、IL-12/IL-23p40和IL-6含量,每組6只,具體操作按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,使用FCAP Array software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    1.5.7小鼠皮損中炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá) 采用realtime PCR法檢測(cè)小鼠皮損中炎癥細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-23和IL-6的mRNA表達(dá)。TRIzol法提取小鼠皮膚總RNA,采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)椋呵疤幚?5 ℃ 30 s,(擴(kuò)增95 ℃,5 s,退火60 ℃,40 s)×45個(gè)循環(huán),每個(gè)樣本重復(fù)3次。結(jié)果以β-actin為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。引物序列見(jiàn)表1。

    2 結(jié)果

    2.1小鼠皮損和PASI評(píng)分 咪喹莫特外涂于小鼠背部皮膚5 d后,模型對(duì)照組小鼠背部皮損增厚、浸潤(rùn)顯著,大量斑塊狀鱗屑,皮色紅。清血消脂方組小鼠皮損紅斑和鱗屑明顯減少,浸潤(rùn)減輕。模型對(duì)照組小鼠PASI評(píng)分隨天數(shù)持續(xù)增高,清血消脂方組第3天開(kāi)始明顯降低(圖1)。

    表1 引物序列

    2.2小鼠皮損病理形態(tài)和表皮厚度 顯微鏡下觀察可見(jiàn)正常對(duì)照組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整,表皮層薄,僅1~2層。模型對(duì)照組小鼠表皮層明顯增厚,出現(xiàn)角化不全和角化過(guò)度,真皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。清血消脂方組小鼠表皮層結(jié)構(gòu)較平整,角化不全明顯減輕,表皮厚度減少(圖2)。采用圖像分析軟件測(cè)量小鼠表皮厚度,與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組小鼠表皮層明顯增厚(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,清血消脂方組小鼠皮膚組織表皮厚度明顯降低(P<0.05)(圖3)。

    2.3小鼠表皮增殖、分化和脂質(zhì)堆積指標(biāo) 采用免疫熒光染色法觀察小鼠Involucrin、PCNA和LOX-1的表達(dá)。正常對(duì)照組小鼠表皮層薄,Involucrin(紅色)和PCNA(綠色)表達(dá)不明顯,LOX-1(綠色)少量表達(dá);模型對(duì)照組表皮層明顯增厚,Involucrin表達(dá)顯著,基底層PCNA表達(dá)數(shù)量顯著增多,表皮和真皮層均可見(jiàn)LOX-1陽(yáng)性表達(dá)。清血消脂方組小鼠Involucrin表達(dá)略有減少,PCNA和LOX-1表達(dá)明顯降低(圖4)。

    2.5小鼠血脂水平 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組小鼠TC、TG、HDL和LDL明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。清血消脂方可顯著降低TG,升高HDL和LDL水平,其作用趨勢(shì)與阿托伐他汀鈣相一致,見(jiàn)表2。

    ①與正常對(duì)照組比較,t=8.837 8~21.213 4,P<0.05;②與模型對(duì)照組比較,t=0.196 5~8.018 0,P<0.05。

    圖2 4組小鼠皮膚組織病理變化(HE,×200)

    ①與正常對(duì)照組比較,t=21.136 9,P<0.05;②與模型對(duì)照組比較,t=5.266 5,6.050 4,P<0.05。

    2.6小鼠血清炎癥因子水平 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組小鼠血清中IL-17A、IL-17F、IL-12/IL-23p40和IL-6顯著升高(P<0.05)。清血消脂方對(duì)IL-17F有一定的抑制作用(P<0.05),見(jiàn)表3。

    2.7小鼠皮損炎癥因子基因表達(dá) 與正常對(duì)照組比較,模型對(duì)照組小鼠血清中IL-17A、IL-17F、IL-23和IL-6 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。清血消脂方可抑制炎癥因子IL-17A、IL-23和IL-6基因表達(dá)(P<0.05),見(jiàn)表4。

    3 討論

    “異病同治”是中醫(yī)辨證論治理論中的基本治則,即不同的疾病在其發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)相同的病機(jī)可采用同一方法治療。近年來(lái),基于“濕邪內(nèi)生”“從濕論治”提出銀屑病具有“內(nèi)濕外燥,燥濕互化”的病機(jī)特點(diǎn)[9]?!皾瘛毙柏灤┯诩膊〉氖冀K,燥濕、血瘀、熱毒三者互結(jié)是銀屑病的基本病機(jī)。脂代謝紊亂屬于“痰濁”范疇,“痰瘀互結(jié)”、“中滿內(nèi)熱”是脂代謝紊亂的主要病機(jī)[10-12]。銀屑病和脂代謝紊亂的病機(jī)中都包含“(痰)濕”這一病機(jī),(痰)濕、熱毒、瘀血既是疾病產(chǎn)生的病理產(chǎn)物,又是致病因素。病邪蘊(yùn)積體內(nèi),痹阻血脈,為痰飲,為血瘀,甚則胸痹;溢于皮之絡(luò)脈,則為白疕。由此,從中醫(yī)學(xué)角度闡釋銀屑病和脂代謝紊亂具有相同的病機(jī),并在同一機(jī)體中同時(shí)出現(xiàn),可采用“異病同治”的治則。

    清血消脂方中虎杖利濕散瘀,大黃通腑降濁、活血祛瘀,使?jié)釟庀滦星鍤馍仙?,為君藥。蒲黃、姜黃行氣活血,助虎杖、大黃活血之力,消其苦寒之弊,茵陳、澤瀉、萆薢利濕濁、化痰飲,為臣藥。佐以白術(shù)、石菖蒲化濕和胃,開(kāi)竅醒脾。紅花為使藥,引諸藥之力祛除血脈之瘀滯。諸藥合用,活血消瘀,祛濕化濁,通腑泄熱。清血消脂方臨床等效劑量可降低ApoE-/-小鼠體內(nèi)血脂水平,抑制小鼠血清及脂肪細(xì)胞炎癥因子IL-6、MIP-1和MCP-1α表達(dá)水平,并通過(guò)調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear transcription factor,NF)-κB和過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPAR)-γ受體,抑制炎癥反應(yīng)[5]。清血消脂方可抑制ApoE-/-小鼠肝臟和巨噬細(xì)胞源泡沫細(xì)胞內(nèi)清道夫受體CD36(cluster of differentiation 36,CD36)、清道夫受體A(scavenger receptor A,SR-A) mRNA和蛋白的表達(dá),減少巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的攝入,抑制泡沫細(xì)胞的形成[13];清血消脂方能夠干預(yù)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型的糖脂類代謝[14]。

    A.正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.清血消脂方組;D.阿托伐他汀鈣組。

    清血消脂方可顯著改善咪喹莫特誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠銀屑病樣皮損,鱗屑和紅斑減少、浸潤(rùn)減輕,表皮厚度變薄,并抑制表皮基底層細(xì)胞增殖(PCNA)、角化不全(Involucrin),減少表皮脂質(zhì)堆積(LOX-1),降低PASI評(píng)分。PCNA是真核細(xì)胞DNA合成所需的核蛋白,在G1期逐漸增加,S期達(dá)到高峰,G2/M期減少,可反映細(xì)胞的增殖活性[15]。模型組小鼠角化不全明顯升高,而清血消脂方對(duì)其有明顯降低作用。LOX-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞oxLDL的主要受體,模型組小鼠皮損中表現(xiàn)出脂質(zhì)聚積,與銀屑病患者皮損存在脂質(zhì)代謝異常的報(bào)道一致[1]。清血消脂方能夠明顯抑制LOX-1表達(dá),減少皮膚的脂質(zhì)堆積。清血消脂方降低TG水平、升高HDL組分,與阿托伐他汀鈣作用結(jié)果一致。TG水平主要受飲食影響,所以普通飼料飼養(yǎng)的復(fù)合模型小鼠TG升高不明顯,但在連續(xù)4周灌服中藥后,觀察到清血消脂方對(duì)降低TG的作用。應(yīng)用脂質(zhì)檢測(cè)技術(shù)證明,降低銀屑病患者HDL膽固醇外排能力(cholesterol efflux capacity,CEC) 有利于調(diào)節(jié)血脂水平[16]。因此,清血消脂方降低TG、升高HDL可抑制脂代謝紊亂向動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。

    ①與正常對(duì)照組比較,t=14.748 9,8.639 9,P<0.05;②與模型對(duì)照組比較,t=1.929 2~6.134 2,P<0.05。

    表2 四組小鼠血脂水平

    銀屑病和脂代謝紊亂都伴有炎癥細(xì)胞的激活和炎癥細(xì)胞因子的升高。銀屑病被認(rèn)為是Th1/Th17/Th22細(xì)胞亞群自身免疫性疾病,IL-23/Th17軸起主導(dǎo)作用[17]。咪喹莫特誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠復(fù)合模型表現(xiàn)出系統(tǒng)性和局部皮損的IL-23/Th17軸激活,表現(xiàn)為皮膚、脾臟和血清中相關(guān)免疫細(xì)胞和炎癥因子的升高,與咪喹莫特對(duì)BALB/c小鼠的免疫發(fā)病機(jī)制一致[6,18]。炎癥因子如IL-17A升高可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇升高,進(jìn)入循環(huán)導(dǎo)致血液膽固醇水平升高,這可能是銀屑病患者發(fā)生脂代謝紊亂的原因[19]。文獻(xiàn)報(bào)道,他汀類藥物有益于銀屑病的治療可能通過(guò)抑制IL-17A信號(hào)途徑[20]。

    表3 4組小鼠血清炎癥因子水平

    表4 4組小鼠皮損炎癥因子mRNA表達(dá)

    清血消脂方可顯著降低小鼠脾臟Th1和Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.05),抑制皮損中炎癥因子IL-17A、IL-23和IL-6的基因表達(dá);同時(shí)對(duì)血清中炎癥因子IL-17F水平有一定的抑制作用。因此,清血消脂方可通過(guò)抑制IL-23/Th17軸發(fā)揮對(duì)銀屑病的干預(yù)作用。

    綜上所述,清血消脂方能夠明顯改善咪喹莫特誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠銀屑病樣皮損,減少鱗屑和紅斑,降低PASI評(píng)分,抑制表皮細(xì)胞增殖、角化不全,減少表皮脂質(zhì)堆積;調(diào)節(jié)血脂水平;抑制局部皮膚和全身IL-23/Th17軸激活。因此,清血消脂方通過(guò)抑制IL-23/Th17軸改善銀屑病樣皮損,從而發(fā)揮對(duì)銀屑病合并脂代謝紊亂的干預(yù)作用。此外,本研究提示調(diào)節(jié)脂代謝紊亂也可能作為治療銀屑病的一個(gè)新的有效策略。

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