藥物性急性肝衰竭動物模型的研究進展及其在中醫(yī)藥研究中的應用▲

林 鏞 彭子明 馮 逢 張建玲 龍富立， 毛德文 韋艾凌，3

(1 廣西中醫(yī)藥大學研究生學院，南寧市 530200，電子郵箱：243560015@qq.com；2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院肝病二區(qū)，南寧市 530023；3 廣西中醫(yī)藥大學成人教育學院，南寧市 530001)

【提要】 急性肝衰竭是一種嚴重而復雜的肝損傷，短時間可迅速危及生命，患者生存預后差，短期死亡率高。建立合適的動物模型，對于疾病機制和治療策略的研究具有重要意義。目前，我國中醫(yī)藥在急性肝衰竭的治療方面表現(xiàn)出巨大潛力。本文對近年來常用的藥物性急性肝衰竭動物模型及其在中醫(yī)藥研究中的應用做一綜述，為急性肝衰竭的深入研究提供模型選擇及評價參考。

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是由多種因素引起的短時間內(nèi)發(fā)生的肝功能損害、凝血功能異常，進而出現(xiàn)肝臟解毒、代謝和合成等功能嚴重障礙和多器官功能衰竭。病理上表現(xiàn)為肝臟大量炎性細胞浸潤和肝細胞壞死，病情進展十分迅速，病死率高達70%～80%[1-2]。目前，藥物保守治療是ALF最主要的治療方法，但尚缺乏特效的藥物。研究表明[3]，在西醫(yī)治療基礎上配合中醫(yī)藥治療能有效改善ALF患者的預后、減少并發(fā)癥發(fā)生、縮短住院時間。本文針對目前國內(nèi)外常見的藥物性ALF動物模型的制備方法和評價指標等方面進行了總結，并介紹藥物性ALF動物模型在中醫(yī)藥研究中的應用進展。

1 實驗動物

目前應用于ALF造模的動物有大鼠、小鼠、兔子、犬、豬、非人靈長類(恒河猴、食蟹猴)[4-5]等，雌雄均有。

1.1 嚙齒 嚙齒動物在ALF模型制備中應用最為廣泛，常用于藥物性ALF模型的建立，大鼠品系一般以 Wistar 和 SD 為主[6-8]；小鼠以 ICR、C57BL/6j、KM在研究實驗中最為多見[9-11]，也有研究用其他品系小鼠，ALF造模對小鼠品系無嚴格要求。

1.2 兔 可用于建造ALF模型的兔品系比較多，造模方式以手術和藥物為主。手術造?？梢暂^為直觀地觀察體內(nèi)情況，因此是研究肝臟外科疾病的首選動物模型，適合人工肝支持系統(tǒng)在ALF中的應用研究[12]。

1.3 豬、犬 豬、犬ALF的造模方式以手術、化學藥物為主。豬、犬作為哺乳動物在遺傳和生理上與人類存在高度相似性，被越來越多的實驗所采用。手術模型多用于測試各種生物型人工肝系統(tǒng)，化學藥物模型常用于研究ALF臨床機制、生化、組織病理變化等[13-16]。

1.4 猴 研究表明，非人靈長類動物肝臟發(fā)育、內(nèi)環(huán)境變化與人類極其相似，其ALF模型在臨床上與患者的臨床特征、肝臟指標、組織病理學、影像學和壽命表現(xiàn)出相似的變化[17]。所以非人靈長類動物ALF模型常用于研究引發(fā)ALF的誘因或潛在的機制及新型病毒基因型試驗[4-5]。

2 建模方法

常見的藥物性ALF動物模型主要使用肝毒性藥物建模，藥物包括對乙酰氨基酚(N-acetyl-p-aminophenol,APAP)、D-氨基半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)、硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)、四氯化碳、刀豆球蛋白A(concanavalin A,ConA)、卡介苗等。不同的建模方法涉及不同的實驗程序，每種動物模型各有優(yōu)勢，但同時存在一定的不足。

2.1 ALF模型的建模方法

2.1.1 APAP：(1)APAP制備模型原理。APAP是一種肝毒性很強的藥物，其誘導肝衰竭機制與氧化應激、線粒體功能障礙、肝細胞壞死等有關[18]。線粒體功能障礙是APAP誘導 ALF 模型成功的主要機制，中毒劑量的APAP 可選擇性地使三磷酸腺苷酶復合體中的高親和力位點失活，從而抑制三磷酸腺苷酶活性并損傷線粒體超微結構，引起肝衰竭[19]。(2)造模方法。①嚙齒動物：以750 mg/kg APAP對小鼠進行腹腔注射，約12 h造模完成[9]。②犬類：Ortega等[13]將雜種犬禁食12 h后，每90 min靜脈注射500 mg/kg一次，注射后24～48 h內(nèi)可發(fā)現(xiàn)犬出現(xiàn)廣泛肝損傷，48 h后出現(xiàn)大量肝壞死，76 h犬的死亡率為100%。趙世峰等[14]采用皮下注射APAP法對雜種家犬進行干預，首次劑量為750 mg/kg，注射后9 h和24 h分別再以200 mg/kg APAP行第2、3次注射。結果顯示，該方法ALF模型成功率為76.7%。③豬類：選取雌性長白豬，按250 mg/kg劑量經(jīng)十二指腸給予APAP，以0.5～4 g/h的維持量將APAP血清濃度維持在300 mg/L以上，直至各指標符合ALF[15]。目前采用APAP制備非人靈長類ALF模型尚未見報道。以上文獻顯示APAP可用于多種動物ALF模型的建造，但中大型動物模型的建模成功率欠佳，小型動物模型的制備較為常見。

2.1.2 D-GalN：(1)D-GalN制備模型原理。D-GalN 可快速結合并消耗體內(nèi)大量尿苷酸，使肝臟核酸、糖蛋白、脂糖等物質(zhì)合成受抑制，進而導致酶的合成和補充受到限制，細胞器生成受阻，對肝細胞組織造成不可逆的損傷。脂多糖能刺激肝臟巨噬細胞、枯氏細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，進而破壞血管內(nèi)皮的完整性，導致肝細胞的凋亡和壞死[20-21]。D-GalN又能加強脂多糖的急性毒性，所以無論單一使用D-GalN或與脂多糖共同作用均可誘導ALF模型。(2)造模方法。① D-GalN與脂多糖共同作用造模。a小鼠：吳小紅等[22]給予C57BL/6j小鼠腹腔注射200 μL 含脂多糖(2.5 mg/kg)和D-GalN(0.3 g/kg)的生理鹽水溶液一次成膜。Lin 等[10]給予C57BL/6j小鼠腹腔注射脂多糖(50 μg/kg)和D-GalN(800 mg/kg)，1 次/d，連續(xù)3 d后完成造模。b大鼠：龍富立等[11]予無特定病原體級大鼠腹腔注射脂多糖(20 μg/kg)/D-GalN(600 mg/kg)，一次成模，時間為48 h；Kitazawa等[23]給予Wistar大鼠腹腔注射D-GalN(500 mg/kg)/脂多糖(50 μg/kg)3 h 后，即可建成ALF模型。c豬類：彭承宏等[16]對雌性家豬經(jīng)門靜脈注射0.5 g/kg D-Ga lN和1 μg/kg脂多糖一次建立豬ALF模型，4 d死亡率為83%。② D-GalN單獨作用造模。a大鼠：劉芳等[24]、Zhang等[25]研究均證實按1.4 g/kg的劑量給予大鼠腹腔注射D-GalN一次后可制備成大鼠ALF模型，該模型在生化學、組織學、臨床表現(xiàn)等方面與人類相似。b豬類：喬玲等[26]采用中國實驗小型豬、郭健文等[27]采用五指山系小豬，分別經(jīng)頸外靜脈和耳靜脈一次性按1.2 g/kg體重量D-GalN腹腔注射制備ALF模型，結果提示兩種注射方法均獲得滿意的豬ALF模型。Wei等[28]同樣通過耳靜脈注射D-GalN構建豬ALF模型，但其D-GalN劑量則為1.5 g/kg。c犬類：Patzer等[29]報道使用異氟醚麻醉后經(jīng)靜脈給予雄性獵犬注射1.5 g/kg D-GalN可成功建立犬ALF模型，犬平均生存時間為43.7 h。d非人靈長類：Feng等[30]以食蟹猴為實驗對象，按0.25 g/kg經(jīng)小隱靜脈注射D-GalN誘導食蟹猴ALF模型，一次成模，約72 h后其臨床表現(xiàn)、生存時間、病理變化等方面都可呈現(xiàn)ALF特點。D-GalN制備模型涉及動物種類較廣，制備方式多為一次成膜且其成模后動物表現(xiàn)與臨床符合程度較高，為目前較為常用的ALF造模藥物，造模方式有腹腔注射、頸靜脈、耳靜脈等。

2.1.3 TAA：(1)TAA制備模型原理。TAA誘導肝損傷的特點是使細胞氧化應激增加和抗氧化防御能力受損，活性氧升高促進脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的積累，導致細胞壞死和肝損傷；其次是TAA可以使生物體釋放大量促炎性介質(zhì)[白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β等]使肝損傷進一步加重[31-32]。(2)造模方法。嚙齒動物：①小鼠。楊天翼[33]按200 mg/kg給予C57BL/6j小鼠腹腔注射TAA，一次成膜，ALF小鼠的病理、血液生化、死亡率均與患者相似。②大鼠。毛德文等[6]按6 mL/kg對無特定病原體級Wistar大鼠皮下注射10%TAA，24 h后重復注射同等劑量，48 h后ALF模型造模成功。張美華等[34]按200 mg/(kg·d)、250 mg/(kg·d)、350 mg/(kg·d)的劑量對無特定病原體級雄性大鼠行腹腔內(nèi)注射TAA 2 d,1次/d,發(fā)現(xiàn)TAA致雄性大鼠ALF及其相關并發(fā)癥(肝性腦病、高內(nèi)毒素等)具有濃度依賴性。之后的大量研究顯示，腹腔注射100 mg/kg[35]、400 mg/kg[36]、600 mg/kg[37]劑量的TAA均可誘導大鼠出現(xiàn)ALF，但須掌握注射的次數(shù)。TAA多用于制備齲齒類動物ALF模型，尚未發(fā)現(xiàn)在中大型動物及非人靈長類動物中應用的相關研究報告。其造模劑量從100～600 mg/kg均有報告，考慮與不同品系鼠類和注射次數(shù)有關，其造模劑量差異較大也導致該造模方法較少使用。

2.1.4 四氯化碳：(1)四氯化碳制備模型原理。四氯化碳進入機體經(jīng)細胞色素P450激活后攻擊細胞膜上的磷脂分子，并與肝細胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)共價結合，進而破壞肝細胞膜結構和功能，影響蛋白質(zhì)代謝和Ca2+內(nèi)流增加，引起肝功能損害和生化血液學指標改變[38]。(2)造模方法。在動物實驗中，常通過灌胃、腹腔注射、皮下注射等給藥方式給予四氯化碳制備動物ALF模型，其中腹腔注射法可以使藥物直接經(jīng)門靜脈作用于肝臟，因此較為常用。嚙齒動物：有學者按4 mL/kg劑量給SD大鼠灌胃30%四氯化碳一次誘導ALF模型，結果顯示ALF大鼠的血清生化學、病理學、病死率等方面都與患者ALF相似[7-8]。豬類：Nardo等[39]對體重為28～35 kg的白色大型雌豬，按450 mg/kg劑量腹腔注射四氯化碳一次建立ALF模型，研究體外門靜脈氧合作用。犬類：張日平等[40]將純四氯化碳與大豆油按體積比1 ∶1.5配制，按0.25 mL/kg于清晨空腹注入雜種犬腹腔，前2周每周注射 1次，后5周每 4 d注射1次，7周可完成造模。還有學者采用四氯化碳聯(lián)合其他藥物或聯(lián)合肝缺血制備ALF模型。如張慧蕓等[41]采用四氯化碳聯(lián)合D-GalN和脂多糖制備BALB/C小鼠慢加ALF模型；Yuasa等[42]在經(jīng)門靜脈注射四氯化碳的同時聯(lián)合肝缺血建立長白雌豬ALF模型。四氯化碳構建ALF動物模型的方法已較為成熟，其可單獨誘導也可聯(lián)合其他藥物共同誘導ALF，考慮到時效性和模型相似性，目前主要以小型動物造模為主。

2.1.5 ConA：(1)ConA制備模型原理。ConA是一種T細胞絲裂原，能激活T淋巴細胞。注射ConA后動物肝實質(zhì)可見大量淋巴細胞浸潤，主要以CD4+、TNF-α、IL-6為主，而后導致肝組織壞死，門靜脈充血及凝血。動物實驗中常用ConA誘導建立肝臟疾病模型，該方法能較好地模擬人類病毒性肝炎、免疫性肝病等[43]。(2)造模方法。王友強[44]和Guo等[45]經(jīng)C57BL/6j小鼠尾靜脈注射20 mg/kg ConA一次，約6 h內(nèi)可觀察到肝損害及炎癥反應，符合ALF表現(xiàn)；朱鏐孌等[46]也發(fā)現(xiàn)一次性靜脈注射15 mg/kg ConA 10 h后可建成C57BL/6j小鼠ALF相似模型；Li等[47]在研究調(diào)節(jié)性T細胞和Th17時發(fā)現(xiàn)，采用12 mg/kg劑量的ConA建立的C57BL/6j成年小鼠ALF模型也同樣符合ALF臨床表現(xiàn)癥狀。

2.1.6 卡介苗：(1)卡介苗制備模型原理。動物實驗中，卡介苗常與脂多糖聯(lián)合誘導ALF模型，機制是卡介苗可使庫普弗細胞、巨噬細胞、T細胞等單核細胞浸潤，而脂多糖可以激活單核細胞引起炎癥反應，兩者共同作用可以導致急性大面積肝壞死[48]。(2)造模方法。Yang等[49]先經(jīng)尾靜脈給予雄性昆明品系小鼠注射卡介苗 2.5 mg(活菌，卡介苗溶于2 mL生理鹽水中)，使小鼠致敏，10 d后再經(jīng)尾靜脈注射10 mg/只脂多糖，約2 h后可誘導小鼠出現(xiàn)ALF。

2.2 ALF模型評價 Terblanche等[50]于1991年提出，理想的ALF動物模型應具備以下特點：(1)有可逆性；(2)模型有可重復性；(3)動物死于ALF；(4)有適當治療窗口期；(5)如是大型動物應連續(xù)監(jiān)測和建立體外循環(huán)，以方便指導臨床應用和效果評價；(6)對環(huán)境、實驗人員危害最小。2000年Fourneau等[51]和Newsome等[52]又做了三點補充：(1)動物模型須有意識，可評估肝性腦??；(2)生理代謝與人相似；(3)符合倫理道德要求。實際研究中，良好的ALF模型其生理、病理、血清等指標需符合Terblanche和 Hickman標準[53]。但目前的動物研究中，均符合上述標準的動物模型較少見，每種模型都有各自優(yōu)勢特點及局限性。如動物種類的選擇上，嚙齒類小型ALF動物模型具有造模方式簡便、重復性高、費用低等優(yōu)勢，能很好地復制臨床ALF癥狀，但其生理代謝與患者存在差異，但行為意識難以評估，常用于疾病機制及藥物治療的研究；兔、犬、豬中大型動物模型與ALF患者的相似程度更高，成膜有較長的治療窗口期，具有一定的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，能夠連續(xù)監(jiān)測和建立體外循環(huán)，常用于檢驗新型生物人工肝功能或新藥或新治療方法的療效評估，但其價格較高，建模的條件要求較為嚴格；非人靈長類動物較少用于建立ALF模型。藥物的選擇上，以D-GalN單獨造模、D-GalN聯(lián)合脂多糖造模、四氯化碳單獨造模最為常見，這些藥物致ALF的原理與臨床ALF發(fā)病機制相似，而且成膜用時較短，用藥方法簡單易行且重復性較高。而隨著科學技術的發(fā)展，藥物結合手術造模、ConA造模等新型造模方式相繼出現(xiàn)，在不久的將來，ALF的動物模型將更加貼近臨床。

3 藥物誘導ALF動物模型在中醫(yī)藥研究中的應用

ALF起病急，病情兇險，病死率高達80%，但ALF的發(fā)病機制尚未明確，尚缺乏特效的治療手段，藥物保守治療及人工肝治療仍是目前治療ALF的主要方法。研究表明在西醫(yī)治療基礎上配合中醫(yī)療法治療可以有效改善患者的臨床癥狀和預后[54]。在ALF動物模型的基礎上，探討中醫(yī)的治療方案可為中醫(yī)治療ALF的研究提供實驗依據(jù)。研究顯示，單味中藥、復方藥及中成藥等對各種ALF動物模型均有治療作用[55-56]。治療機制涉及代謝組學、蛋白質(zhì)組學、基因組學、腸道菌群、免疫等各方面。還有研究顯示，穴位注射可通過刺激經(jīng)絡腧穴達到利膽退黃、增強免疫作用，從而促進肝功能的恢復，穴位可選用調(diào)節(jié)肝膽、脾胃經(jīng)的腧穴，如肝俞、中都、日月、脾俞、足三里、期門等[57]。同樣的還有中藥提取物和中藥化合物，例如黃旭等[58]所采用的石見穿多糖能有效保護由內(nèi)毒素/D-GalN誘導的ALF小鼠肝細胞損害，降低肝氧化應激和抑制肝炎癥反應；寇小妮等[59]發(fā)現(xiàn)臭牡丹大黃提取素可以減輕ALF小鼠肝細胞壞死和凋亡，其機制可能與抑制小鼠ERS信號分子有關；毛云等[60]則是通過人參皂苷化合物誘導骨髓間充質(zhì)干細胞的分化合成從而改善ALF大鼠肝功能,機制可能與加速肝臟再生有關。

4 小 結

ALF的發(fā)病機制復雜，良好的ALF動物模型可為ALF的機制研究提供實驗依據(jù)，但目前各種肝損傷模型還存在缺陷，尚難以完全復制人體肝損傷的病理生理過程。制備更全面、更完善的ALF動物模型仍是將來研究的重點，今后可考慮多種造模方法聯(lián)合應用，揚長避短，建立穩(wěn)定且符合貼近臨床的動物模型。同時，中醫(yī)治療ALF的研究尚處于起步階段，治療方法及療效的評估尚未規(guī)范統(tǒng)一，今后仍需充分利用ALF動物模型，從“證候”角度研究中醫(yī)辨證治療ALF的機制，為中西醫(yī)結合治療ALF提供新的思路。