快速評(píng)估過(guò)氧化氫酶的方法研究

尤 雅 張秀紅 黃 甜 李雪梅 孟 勇

綿陽(yáng)禾本生物工程有限公司，四川綿陽(yáng)621000

目前市售商品過(guò)氧化氫酶種類繁多，質(zhì)量良莠不齊。多數(shù)評(píng)判過(guò)氧化氫酶的方法是采用酶學(xué)性質(zhì)比較，但此方法操作繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間。本文旨在建立一套快速評(píng)估過(guò)氧化氫酶的方法，為使用者選擇過(guò)氧化氫酶提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取4 個(gè)不同廠家的液體過(guò)氧化氫酶，分別編號(hào)A、B、C、D；德國(guó)默克（MERCK）過(guò)氧化氫快速檢測(cè)試紙條，操作方法見說(shuō)明書。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

1）主要試劑。30%過(guò)氧化氫、無(wú)水磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、硫代硫酸鈉、硫酸等，以上試劑均為分析純。

2）儀器設(shè)備。78HW-1 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，杭州儀表電機(jī)有限公司；SHA-CA 水浴恒溫振蕩器，常州冠軍儀器制造有限公司；堿式滴定管；pH 計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

對(duì)過(guò)氧化氫酶A、B、C、D 進(jìn)行酶活檢測(cè)、電泳圖譜及過(guò)氧化氫試紙條試驗(yàn)。

1）酶活檢測(cè)。采用硫代硫酸鈉滴定法，對(duì)A、B、C、D 進(jìn)行酶活檢測(cè)。

2）NATIVE-PAGE 電泳圖譜。參照文獻(xiàn)[1]方法，測(cè)定A、B、C、D 的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量。

3）過(guò)氧化氫試紙條試驗(yàn)。用純水將樣品A、B、C、D 酶活統(tǒng)一稀釋成10 萬(wàn)倍；配制0.1%的過(guò)氧化氫溶液，分別調(diào)至pH 2.5、pH 3.5、pH 11.5；取同一pH 值的過(guò)氧化氫溶液100 mL，分別加入統(tǒng)一酶活的過(guò)氧化氫酶，酶添加量0.02%；每分鐘用過(guò)氧化氫試紙條檢測(cè)溶液中過(guò)氧化氫的殘留。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶活檢測(cè)

4 種過(guò)氧化氫酶的檢測(cè)酶活與廠家標(biāo)識(shí)酶活差異較大，A、C 檢測(cè)酶活低于標(biāo)識(shí)酶活，B、D 檢測(cè)酶活高于標(biāo)識(shí)酶活。

2.2 NATIVE-PAGE 電泳圖譜

4 種過(guò)氧化氫酶電泳圖譜的差異，A 主條帶蛋白分子質(zhì)量在95 ku 附近；B 主條帶蛋白分子質(zhì)量在130 ku 附近；C 和D 電泳圖譜相似，主條帶蛋白分子質(zhì)量分別在72，95 和130 ku 附近。

2.3 過(guò)氧化氫試紙條試驗(yàn)

此試驗(yàn)中顏色越深表示過(guò)氧化氫殘留越多，過(guò)氧化氫酶降解過(guò)氧化氫效果越差。

1）pH 2.5 條件下，4 種過(guò)氧化氫酶的試紙條結(jié)果。在pH 2.5 條件下，B 在反應(yīng)4 min 時(shí)試紙條變?yōu)闊o(wú)色，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)比色卡過(guò)氧化氫含量為0 mg/L，表明溶液中過(guò)氧化氫已被降解完；A、C、D 在反應(yīng)4 min 時(shí)試紙條顏色仍為深藍(lán)，超出標(biāo)準(zhǔn)比色卡顏色范圍，且與0 min 顏色無(wú)差異，表明溶液中過(guò)氧化氫幾乎沒被降解。

2）pH 3.5 條件下，4 種過(guò)氧化氫酶的試紙條結(jié)果。在pH 3.5 條件下，A、B、D 在反應(yīng)8 min 時(shí)試紙條變?yōu)闊o(wú)色，表明溶液中過(guò)氧化氫已被降解完；C 在反應(yīng)8 min 時(shí)試紙條顏色較淺，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)比色卡過(guò)氧化氫含量在0.5 mg/L 左右，表明溶液中還有微量的過(guò)氧化氫沒被降解。

3）pH 11.5 條件下，4 種過(guò)氧化氫酶的試紙條結(jié)果。在pH 11.5 條件下，A、C、D 在反應(yīng)5 min 時(shí)試紙條變?yōu)闊o(wú)色，表明溶液中過(guò)氧化氫已被降解完；B 在反應(yīng)5 min 時(shí)試紙條顏色較淺，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)比色卡過(guò)氧化氫含量在0.5～2.0 mg/L，表明溶液中還有微量的過(guò)氧化氫沒被降解。

3 討 論

從試紙條試驗(yàn)可以看出，在pH 2.5 條件下，B降解過(guò)氧化氫效果最好，A、C、D 幾乎沒有降解效果，表明B 耐酸性好，A、C、D 不耐酸，在pH 2.5 時(shí)均已失去活性。在pH 3.5 條件下，A、B、D 降解過(guò)氧化氫效果相當(dāng)，略優(yōu)于C。在pH 11.5 條件下，A、C、D 降解過(guò)氧化氫效果相當(dāng)，略優(yōu)于B，表明4 種過(guò)氧化氫酶均有良好的耐堿性。

4 種酶的不同，其蛋白分子質(zhì)量不一樣，C 和D的條帶相似，但與A、B 各不相同，可能是因?yàn)槠渖a(chǎn)過(guò)程不一樣，如菌種、生產(chǎn)工藝不同，導(dǎo)致4 種過(guò)氧化氫酶存在差異。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)只判斷了4 種過(guò)氧化氫酶的耐酸堿性，如需判斷耐溫性，可對(duì)過(guò)氧化氫酶進(jìn)行耐溫處理后再進(jìn)行試紙條對(duì)比試驗(yàn)。此方法能夠快速判斷過(guò)氧化氫酶在不同條件下降解過(guò)氧化氫的效果，從而判斷其性質(zhì)，這為使用者選擇高效優(yōu)質(zhì)的過(guò)氧化氫酶提供一定的理論基礎(chǔ)。