腹瀉犢牛大腸埃希菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

張 成

山東省鄒平市長山鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山東濱州256207

犢牛大腸桿菌性腹瀉為一類獸醫(yī)臨床中較為常見的疾病，半月以內(nèi)的新生犢牛為發(fā)生此病的主要群體，春冬季為好發(fā)季節(jié)，死亡率高、發(fā)病急、病程短。依照犢牛的具體臨床表現(xiàn)可分為3 個(gè)類型，即腸炎型、腸毒血型和敗血型。如果未能及時(shí)對犢牛開展治療，數(shù)日內(nèi)即可死亡。

很多犢牛于10～14日齡后發(fā)生疾病，患病后體溫會升高到40～41 ℃，24 h 后會排出膠凍樣黃色糞便，內(nèi)部含有大量血絲以及黏液。在病期延長時(shí)，病畜可繼發(fā)性出現(xiàn)腕關(guān)節(jié)和副關(guān)節(jié)腫大，有的病畜還會表現(xiàn)出肺炎以及支氣管炎的癥狀[1]。

1 材料與方法

1.1 材 料

1）試驗(yàn)選擇2020年3月25日某養(yǎng)殖場內(nèi)發(fā)病犢牛尸體組織為病原來源，取其淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、心臟組織以及血液。

2）培養(yǎng)基種類為生化鑒定培養(yǎng)基、鮮血平板、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、SS 培養(yǎng)基與LB 以及麥康凱培養(yǎng)基。

3）生化試劑種類：革蘭氏染色劑中包含碘片、濃度為95%乙醇、結(jié)晶分析純化學(xué)試劑、草酸銨、堿性復(fù)紅以及碘化鉀。

4）生化鑒定試劑：硫化氫、無水乙醇、甲基紅、氫氧化鉀、硫酸鈉、硫化亞鐵、α-萘酚、靛基質(zhì)、蔗糖、甘露醇、麥芽乳糖以及葡萄糖。

5）藥敏試驗(yàn)：藥敏紙片具體為土霉素、恩諾沙星、硫酸鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素等。

6）試驗(yàn)動物：10 只雄性小白鼠，體重為18～20 g。

1.2 研究方法

1）流行病學(xué)調(diào)查。工作人員全面探究飼養(yǎng)場當(dāng)前管理情況、消毒情況、當(dāng)?shù)靥鞖?、疾病具體發(fā)病過程、犢牛死亡情況、發(fā)病情況、具體癥狀以及解剖學(xué)病理改變，目的在于深度了解疾病的發(fā)生特點(diǎn)。

2）病料具體采集過程以及鏡檢過程。依照無菌操作原則，收集病牛尸體淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、心血組織，同時(shí)完成涂片工作。在此之后實(shí)施染色以及鏡檢。

3）大腸埃希菌分離以及培養(yǎng)。將以上組織分別接種在LB 肉湯內(nèi)實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)，環(huán)境溫度為37 ℃，接種時(shí)間為24 h，然后實(shí)施革蘭氏染色與鏡檢觀察。

4）大腸埃希菌純化。開展細(xì)菌分離培養(yǎng)工作，把脾臟、肝臟等組織分別接種在新鮮兔血營養(yǎng)瓊脂平板中，每類臟器接種平板為4 份。其中，2 份實(shí)施普通需氧菌培養(yǎng)，另外2 份實(shí)施厭氧菌培養(yǎng)，將其放入溫度為37 ℃的恒溫箱中24 h 查看結(jié)果。針對于分離出的細(xì)菌開展革蘭氏染色與鏡檢，然后將細(xì)菌進(jìn)行純培養(yǎng)，將純培養(yǎng)物接種在麥康凱培養(yǎng)基、三鐵斜面穿刺培養(yǎng)基以及LB 培養(yǎng)基內(nèi)，于37 ℃環(huán)境下需氧培養(yǎng)24 h，在此之后查看最終結(jié)果。

5）生化鑒定步驟。糖分解試驗(yàn)：取用分離菌24 h純培養(yǎng)物，接種在麥芽甘露醇培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)處理24 h，溫度為37 ℃，查看結(jié)果。MR/VP 試驗(yàn)過程擇取分離菌培養(yǎng)物，將其接種到葡萄糖蛋白胨水溶液內(nèi)，培養(yǎng)處理24～48 h，溫度為37 ℃，并在其中添加指示劑[2]。

6）硝酸鹽還原。試驗(yàn)取用分離純培養(yǎng)物質(zhì)接種到硝酸鹽培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)處理24 h，環(huán)境溫度為37 ℃，加入試劑乙以及試劑甲。如果在0.5 min 內(nèi)轉(zhuǎn)為紅色，即可視為陽性；如果沒有顏色，則應(yīng)增加少量鋅粒，若出現(xiàn)紅色為陰性試驗(yàn)。

7）藥敏試驗(yàn)。本試驗(yàn)應(yīng)用藥敏紙片法開展藥敏試驗(yàn)工作，常用種類為四環(huán)素類以及青霉素類藥物。

8）動物試驗(yàn)。本試驗(yàn)實(shí)施動物致病性試驗(yàn)，將分離取得的大腸桿菌接種自營養(yǎng)肉湯內(nèi)，培養(yǎng)10 h，溫度環(huán)境設(shè)定為37 ℃。取用培養(yǎng)液接種試驗(yàn)動物，同時(shí)設(shè)立對照組。

9）溶血試驗(yàn)。本試驗(yàn)應(yīng)用平板法對分離溶血的特性加以測定，工作人員把大腸桿菌菌種接種到濃度為5% LB 平板內(nèi)培養(yǎng)處理48 h，溫度設(shè)定為37 ℃，查看溶血情況，若菌落四周出現(xiàn)溶血圈，則判定為陽性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

通過開展動物試驗(yàn)病原菌分離鑒定試驗(yàn)，觀察病理改變、查看臨床癥狀以及實(shí)施流行病調(diào)查，結(jié)果表明：該養(yǎng)殖場內(nèi)犢牛死亡原因?yàn)榇竽c桿菌感染所致。

經(jīng)藥敏試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：大腸桿菌菌株針對于各類藥物敏感性存在較大差異。其對于慶大霉素以及硫酸鏈霉素敏感性強(qiáng)，對于四環(huán)素以及新霉素耐藥[3]。

3 討 論

當(dāng)前，學(xué)術(shù)界已確定共計(jì)3 類大腸桿菌會導(dǎo)致犢牛腹瀉。

1）產(chǎn)熱較為穩(wěn)定或者熱不穩(wěn)定的腸毒素大腸桿菌，其也被稱為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌。

2）大腸桿菌定植于小腸黏膜，但不會生成復(fù)雜腸毒素。上述菌株能以特異性的方式吸附于動物腸腔表面腸細(xì)胞中，常于杯狀凹陷內(nèi)或者胞漿突起之上。大腸埃希菌吸附于腸上皮表面，經(jīng)常引發(fā)微絨毛脫落。學(xué)術(shù)界將此類病變稱之為吸附脫落病理改變。

3）大腸桿菌定植于動物大腸表面所引發(fā)的輕微痢疾，這種情況也會導(dǎo)致AE 病變。上述菌株會引發(fā)大腸出血，所以其也被稱為腸出血性大腸桿菌。某些腸出血性大腸桿菌和腸致病性大腸桿菌會產(chǎn)生一類毒素，能夠消滅體外培養(yǎng)的Vero 細(xì)胞，其可被稱為類志賀毒素或者Vero 細(xì)胞毒素。這種毒素不會引發(fā)AE病變，但會參加到相關(guān)致病過程中。

如果犢牛便內(nèi)帶血，尤其是便內(nèi)無分離的沙門氏菌以及隱孢子蟲狀況下，若發(fā)現(xiàn)大腸以及小腸黏膜有關(guān)大腸桿菌，就可以推斷其為腸致病性大腸桿菌。

本組試驗(yàn)結(jié)果表明：該養(yǎng)殖場內(nèi)犢牛死亡原因?yàn)榇竽c桿菌感染所致。藥敏試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：菌株對于慶大霉素以及硫酸鏈霉素敏感性強(qiáng)，對四環(huán)素和新霉素耐藥，出現(xiàn)這一情況的原因和長期盲目用藥有關(guān)?；诖耍ㄗh相關(guān)人員在治療犢牛大腸桿菌病過程中，有必要定期輪換用藥，最好是先實(shí)施藥敏試驗(yàn)，擇取敏感藥物開展有效治療，以免造成經(jīng)濟(jì)損失。

要想預(yù)防此類疾病發(fā)生，務(wù)必要做好綜合化防治舉措，降低各類應(yīng)激因素出現(xiàn)率。強(qiáng)化對于牛犢的飼養(yǎng)管理力度，做好牛舍通風(fēng)，落實(shí)各項(xiàng)衛(wèi)生保健舉措。另外值得說明的是，飼養(yǎng)主也有必要增加清洗犢牛飲奶器具的頻次。