淚液蛋白質(zhì)組學分析在眼部疾病中的應(yīng)用及研究進展

伍 滿，譚 亭，王 平

0引言

淚液是由多種成分構(gòu)成的混合物，其中任何成分的質(zhì)或量的變化或可提示疾病的發(fā)生、發(fā)展，近年來越來越多的研究者聚焦于淚液標本的研究，以此來探尋相關(guān)疾病。目前研究表明，淚液由水和蛋白質(zhì)、電解質(zhì)、糖類、有機酸、核苷酸、甾醇、維生素、脂類、碳水化合物及其它低分子量和高分子量化合物等組成，水約占其中的98%～99%[1-2]。淚液各個成分的相對穩(wěn)定維持著眼部的健康，同時淚液成分的變化也受眼部疾病的影響，如Kalló等[3]研究的糖尿病眼部并發(fā)癥及甲狀腺相關(guān)疾病等都可引起淚液成分的變化，淚液作為非侵襲性的檢測體液的理想材料，近年來引起了廣泛的關(guān)注，學者們研究了其在眼部疾病中的變化，現(xiàn)將應(yīng)用蛋白質(zhì)組學研究方法分析淚液成分變化及其與眼部疾病的關(guān)系進行綜述[4]。

1淚液標本的收集與保存

淚液的收集方法對標本的影響較大，所以，采用正確的收集方法對結(jié)果的可靠性至關(guān)重要。為了盡量減少對淚液成分的影響，采集時多采用無麻醉且無刺激下收集，目前收集淚液標本的方法多為以下幾種，即玻璃微毛細管收集[5-6]、Schirmer試紙收集、吸收性濾紙片及纖維素海綿、棉線[4,7]；玻璃微毛細管是從眼外直接抽吸眼液。它被認為是避免反射性淚液分泌的最佳方法[8]。但是，處理時需要足夠的經(jīng)驗和技術(shù)，并且很耗時。因此，在實驗研究或臨床應(yīng)用中是有局限性的，如涉及兒科人群時。此外，對于焦慮或不合作的患者，都將引起不可靠的結(jié)果；Schirmer試紙在干眼癥的診斷中是一種簡便而快捷的眼淚收集方法，也適用于臨床常規(guī)檢查[9]。紙帶被放置在每只眼睛的下穹窿中，并留在原處，直到紙帶被潤濕到控制線為止。但是，試紙條可能會引起強烈刺激，從而導致不必要的分析物稀釋；海綿是從眼外收集淚液，大多患者可以很好地耐受，此外，海綿可以標準化收集眼淚體積，將不同材料的海綿和各種提取緩沖液進行組合和測試，以優(yōu)化淚液收集方法并克服最常見的局限性，但是很難比較結(jié)果，另一個主要問題是某些細胞因子與海綿緊密結(jié)合，在提取過程中造成困難，用這種方法也可能發(fā)生眼淚反射，導致不必要的稀釋[10]；有研究報道另一種適用于淚液較少的患者的方法：眼淚沖洗技術(shù)(具體操作方法是將50～60μL平衡鹽液沖洗眼瞼至眼瞼褶皺，用無菌塑料微管快速收集眼淚)[11]。此外，最新研究報道了一種與眼前表面接觸的尖端[眼前接觸尖端(PCT)]以使對眼表面的損害最小化的收集淚液的方法，報道稱此比玻璃毛細管損傷更小[12]，但目前使用玻璃毛細管收集眼淚仍是最常用的、避免眼淚反射的最佳采樣方法[13]。標本的保存對成分的影響同樣重要，目前研究推薦淚液標本的保存溫度包括-80℃、-70℃、-20℃以及4℃[3, 14-17]，深低溫凍是淚液樣品存儲的首選方式[15]。

2淚液蛋白質(zhì)組學

蛋白質(zhì)組學是澳大利亞科學家于1994年提出的[18]，起初多被用于腫瘤標記物的測定[19]，后逐漸用于眼部疾病[20-23]，其過程主要包括蛋白質(zhì)的分離、鑒定及相互作用，實現(xiàn)手段包括多維色譜法(如離子交換色譜法等)、多維電泳技術(shù)(如二維凝膠電泳等)、親和法(如免疫印記法等)、細胞器、膜復合體分離、氨基和羧基末端分析、質(zhì)譜法(如肽片段質(zhì)譜及串聯(lián)質(zhì)譜)、免疫共沉淀、酵母雙雜交系統(tǒng)、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等，其中質(zhì)譜法是應(yīng)用較為前沿的一種常用技術(shù)[24]。淚液分析是一種新的診斷疾病的方法，有研究表明，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學在淚液中發(fā)現(xiàn)了1543種蛋白質(zhì)，其鑒定的錯誤率小于1%，這是目前報道的最多的淚液中存在的蛋白質(zhì)數(shù)量，其中溶菌酶(2～4mg/mL)、乳鐵蛋白(1.2～3mg/mL)和脂鈣素(1～2mg/mL)是含量最高的蛋白質(zhì)[25]。蛋白質(zhì)在眼部起著重要生物功能，如抗炎(如溶菌酶可裂解細菌的細胞壁)、抗病毒、參與免疫反應(yīng)、凝血過程、能量反應(yīng)過程、氧化應(yīng)激反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、予結(jié)膜角膜等提供營養(yǎng)和生長因子[26]參與眼表組織損傷重塑，與淚膜中的脂質(zhì)不可逆結(jié)合，參與淚膜表面張力形成、流變學和動力學等[25]。

3蛋白質(zhì)組學在眼部疾病中的應(yīng)用

3.1干眼眼淚中的蛋白質(zhì)對維護眼表功能具有重要作用，而眼淚成分的質(zhì)和量的變化都反映了眼表健康狀況，據(jù)報道稱干眼的發(fā)病率目前已從2%上升到50%以上[27]，影響著全球一半人的眼表健康，且仍有繼續(xù)增加的趨勢，現(xiàn)已有較多研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學的方法發(fā)現(xiàn)干眼患者中存在許多蛋白質(zhì)的變化，如Jung等[28]研究發(fā)現(xiàn)干眼患者的淚液中蛋白的最大數(shù)量為1700種，比健康人群的1 500多種多出100余種，并認為干眼最重要的發(fā)病機制為淚液中異常蛋白質(zhì)引起的免疫炎癥反應(yīng)。不同原因?qū)е碌母裳鄣鞍踪|(zhì)變化不同，Perumal等[27]表示在大多干眼患者淚液中普遍存在S100-A8蛋白顯著增加的現(xiàn)象，且富含脯氨酸的蛋白4、溶菌酶C(LYZ)及蛋白3和α-1-抗胰蛋白酶的蛋白質(zhì)含量也增加，而細胞外糖蛋白、α-烯醇化酶、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白1、α-1-酸性糖蛋白1、醛脫氫酶等蛋白質(zhì)則存在降低現(xiàn)象；在淚液缺乏型干眼中則主要是表達免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)功能降低了，而表達炎癥反應(yīng)，分解代謝過程，細胞死亡，創(chuàng)傷反應(yīng)等的蛋白質(zhì)數(shù)量明顯增加；Aluru等[29]發(fā)現(xiàn)在繼發(fā)于類風濕關(guān)節(jié)炎的干眼中，80%以上的病例中都顯示核糖核酸酶p蛋白亞基20、原鈣黏蛋白和異核核糖核蛋白q亞型6表達下調(diào)，而二磷酸腺苷核糖基轉(zhuǎn)移酶5抗體、RhoGTP酶等蛋白表達則上調(diào)，而半乳凝素3降低[30]，Nod-1蛋白的表達是增加的[31]，Aqrawi等[32]的研究也認為干眼的發(fā)生與患者淚液中DNA裂解酶、重組人過氧化物還原酶3、鈣離子依賴性的磷脂結(jié)合蛋白酶1、順烏頭酸合酶、LIM域特有蛋白7等的蛋白升高有明顯關(guān)系。干眼患者淚液中蛋白質(zhì)的變化量龐大復雜，目前尚無一致結(jié)論，大部分蛋白質(zhì)的變化與炎癥及免疫反應(yīng)有關(guān)[33-36]，這或可提示著干眼的病因治療更側(cè)重于抗炎及免疫調(diào)節(jié)。

3.2瞼緣炎瞼緣炎因其缺乏早期診斷依據(jù)，在臨床上治療相對困難，研究表明，瞼緣炎患者的淚液成分也有改變，如Kim等研究表示運用二維電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)瞼緣炎患者與健康患者淚液成分相比，血清白蛋白前體、α-1抗胰蛋白酶、催乳素、溶菌酶、催乳素誘導蛋白、胱抑素-SA Ⅲ、丙酮酸激酶及一種未命名的蛋白質(zhì)的表達都至少下調(diào)了50%[37]，而Song等[38]則發(fā)現(xiàn)慢性瞼緣炎患者淚液中分泌型Ⅱ型PLA2活性顯著高于正常對照組，并表明此酶可增加磷脂的水解而降低淚膜的穩(wěn)定性，瞼緣炎淚液成分的變化或可給予其早期診斷提供新指標，但其淚液成分變化的研究尚少，其機制及意義有待進一步詳細研究。

3.3結(jié)膜松弛對于結(jié)膜松弛的患者以淚液做標本應(yīng)用蛋白質(zhì)組學的研究尚少，有研究應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡等技術(shù)在結(jié)膜松弛患者的淚液中鑒定出一系列蛋白質(zhì)表達上調(diào)，例如S100A4，S100A8和重組人過氧化物還原酶-5等，且這些蛋白被認為是炎癥和氧化過程的標志物，以此猜測其表達水平可能有助于評估疾病的嚴重程度和進展[39]，但結(jié)膜松弛的發(fā)病機制是否與淚液中的蛋白質(zhì)變化相關(guān)，可以從機制中阻斷該疾病的發(fā)生發(fā)展，這些仍是目前存在的問題。

3.4角、結(jié)膜炎角、結(jié)膜炎在臨床上極其常見，嚴重影響患者視力，現(xiàn)已有大量研究表示了該疾病存在明顯的淚液成分變化，Li等[40]研究表明在過敏性結(jié)膜炎患者的淚液中發(fā)現(xiàn)其總蛋白濃度及一些主要的淚液蛋白成分增加，如脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2的含量升高，而Leonardi等[41]通過iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)，春季角結(jié)膜炎患者淚液標本中血清白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和血紅蛋白的水平比對照淚液水平高100倍，并表示其與疾病的嚴重程度相關(guān)，同時其血紅素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳球蛋白β和分泌球蛋白表達明顯增加，而在局部使用環(huán)孢素或皮質(zhì)類固醇激素治療后其淚液樣本中這些蛋白質(zhì)水平則明顯降低，該結(jié)果提示其中某些蛋白質(zhì)的變化與該疾病有一定相關(guān)性。在熱帶地區(qū)，曲霉菌和鐮刀菌更易感染導致霉菌性角膜炎，Parthiban等[42]認為在對曲霉菌感染的患者的淚液標本進行分析時發(fā)現(xiàn)，α-1抗胰蛋白酶、載脂蛋白、結(jié)合珠蛋白-α鏈、結(jié)合珠蛋白-β鏈、乳鐵蛋白及白蛋白隨疾病進展表達量增加，而催淚蛋白前體、胱抑素SN前體和鋅α-2糖蛋白(ZAG)在晚期則表達下調(diào)，且ZAG存在于疾病整個過程，同時在鐮刀菌感染患者中ZAG也出現(xiàn)了變化，該研究提示在疾病早期就可通過檢測ZAG的水平作用檢測黃曲霉菌或鐮刀菌的感染，提示了解ZAG在其中的作用對角、結(jié)膜炎可能會帶來新的早期診斷標準及干預措施。

3.5圓錐角膜圓錐角膜(keratoconus，KC)是一種進行性角膜變薄疾病，與重要的組織重塑和多種信號網(wǎng)絡(luò)的激活有關(guān)，該病的病因尚不清楚，治療困難，所以探討其致病因素將對臨床有重要意義。Yenihayat等[43]通過熒光2D凝膠電泳與MALDI-TOF/TOF聯(lián)用研究發(fā)現(xiàn)圓錐角膜患者的淚液中的血清清蛋白、角蛋白Ⅱ型細胞骨架1、免疫球蛋白γ-1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、α-1抗胰蛋白酶和載脂蛋白A1等表達出現(xiàn)下調(diào)，但溶菌酶C、角蛋白I型細胞骨架10和脂蛋白的表達則出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象，以此研究者推測這些蛋白將參與圓錐角膜形成重要步驟；Pannebaker等[44]應(yīng)用質(zhì)譜等方法研究也發(fā)現(xiàn)在圓錐角膜患者的淚液標本中都出現(xiàn)了基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達增加，且猜測與其相關(guān)的一些特征性蛋白質(zhì)，其中包括幾種角蛋白、免疫球蛋白α和κ、催乳素的前體，溶菌酶C和脂蛋白等，但具體與圓錐角膜的病因的相關(guān)性仍待進一步探討。另一方面Balasubramanian等[45]應(yīng)用電泳、質(zhì)譜、光譜技術(shù)等方法研究KC淚液標本，發(fā)現(xiàn)患者的眼淚中組織蛋白酶B的水平上調(diào)了3倍,而聚合免疫球蛋白受體則約下調(diào)了9倍之多，纖維蛋白原α鏈下調(diào)約8倍，胱抑素S和胱抑素SN則下調(diào)約2倍，且研究者還發(fā)現(xiàn)角蛋白1型細胞骨架14和角蛋白2型細胞骨架5僅存在于KC患者的淚液中，而其在KC的病理生理過程中具體扮演什么角色尚不可知，但發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制劑的減少和蛋白酶的增加提示了KC的潛在分子機制，通過蛋白質(zhì)機能途徑分析還發(fā)現(xiàn)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原態(tài)衍生物(NADHX)修復途徑參與了KC過程，而NADHX是幾種脫氫酶的抑制劑，影響大多正常生理過程，這或是KC形成的重要步驟，同時為KC的治療及預防提示了新方向[46]。

3.6葡萄膜炎對于葡萄膜炎患者的淚液標本做蛋白質(zhì)組學研究極少，少量報道了特發(fā)性關(guān)節(jié)炎兒童葡萄膜炎患兒以眼淚為標本行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜等方法，發(fā)現(xiàn)標本中含有SEMA3G，TIMP1，HEXB，ERN1和SAA1等具有較高的與炎性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的蛋白質(zhì)的表達，但具體關(guān)聯(lián)尚待繼續(xù)探討[47]。

3.7青光眼青光眼是全球不可逆性失明的主要原因之一,早期診斷仍是主要挑戰(zhàn)。有報道以患者淚液為標本應(yīng)用蛋白質(zhì)組學做相關(guān)研究，結(jié)果顯示原發(fā)性開角型青光眼與對照組相比，發(fā)現(xiàn)其中的差異蛋白，且這些蛋白與炎癥反應(yīng)、自由基清除、細胞間信號傳導和相互作用有關(guān)，以此猜測淚液中表達的相關(guān)炎癥的蛋白質(zhì)可能是原發(fā)性開角型青光眼潛在的生物標志物[48],還有研究者發(fā)現(xiàn)，長期使用相關(guān)抗青光眼藥物的患者眼淚標本，與非藥物治療組比較，S100-A8、S100-A9、乳腺珠蛋白B和14-3-3ζ/δ的淚液水平顯著增加，局部藥物治療不到1a的淚液中顯示富含脯氨酸的4蛋白水平降低，使用局部抗青光眼藥物治療時間超過1a可能會引起眼表的炎癥反應(yīng)，該結(jié)果對抗青光眼的藥物治療具有一定指導意義[49]，也為青光眼發(fā)病機制研究提供了新方向。

3.8甲狀腺相關(guān)眼病甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid associated ophthalmopathy,TAO)淚液的蛋白質(zhì)譜分析主要表現(xiàn)為血清白蛋白和免疫球蛋白κ鏈C區(qū)的明顯降低和補體C3幾乎完全缺失以及血漿白蛋白的減少，從而降低了細胞外的抗氧化及防御，而氧化應(yīng)激反應(yīng)不但引起嚴重的組織損傷，也加速炎癥的進展，補體C3是三條補體激活途徑的重要組成部分，但在關(guān)于免疫球蛋白k區(qū)C鏈的減少，如何影響TAO的機制仍待進一步研究[50]。還有研究者經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳發(fā)現(xiàn)TAO患者淚液標本中溶菌酶C、乳鐵蛋白等表達均上調(diào)，這可能分別預示著眼眶和淚腺的免疫性炎癥的進程及氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)展。并且研究認為兩者在防止細菌入侵方面具有協(xié)同作用，并猜測兩者在TAO發(fā)病的免疫機制中可能存在著協(xié)同的作用[51]。

4總結(jié)與展望

隨著蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)的發(fā)展，為眼部疾病的病因研究及治療提供了新思路，可以更準確地測定淚液成分變化與疾病密切相關(guān)的特征性改變,為疾病的診斷及藥物療效的評價提供依據(jù)，我們可以以此為思路用于更多的疾病研究，探索其他眼部疾病乃至全身疾病在淚液成分中的特征性改變，淚液標本或可成為常規(guī)體液檢查，這或可比現(xiàn)有的檢查方法更方便、無創(chuàng)、快速，對淚液標本的探索將對眼部疾病的臨床診斷和治療帶來巨大的革新。