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    血清miR-31可用于非小細胞型肺癌診斷

    2019-07-26 01:22:08劉日清黃仁林
    分子影像學(xué)雜志 2019年3期
    關(guān)鍵詞:標志物肺癌血清

    劉日清,黃仁林,梁 柱

    1廉江市人民醫(yī)院心胸外科,廣東 廉江 524400;2廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科,廣東 湛江 524021

    非小細胞型肺癌(NSCLC)只有約20%可以早期切除,然而在接受手術(shù)的患者中,大約50%復(fù)發(fā),主要復(fù)發(fā)原因是遠處轉(zhuǎn)移[1]。NSCLC預(yù)后的主要影響因素是腫瘤的臨床分期,但是既往研究發(fā)現(xiàn),具有相同臨床分期和其他臨床特征的患者的預(yù)后存在顯著差異,而通過將分子生物標志物的評估與傳統(tǒng)癌癥分期相結(jié)合可以改善NSCLC的管理[2],miRNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因的翻譯并影響一系列細胞功能如增殖、分化和凋亡。目前已有大量研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組織中miRNA表達發(fā)生明顯改變,且與預(yù)后和治療結(jié)果相關(guān),miRNA能夠提供比單獨的單個標記物或基因表達譜的表達更準確的預(yù)后預(yù)測[2-3]。miRNA-31作為目前臨床研究較少的一種微小RNA分子,在部分臨床研究及動物實驗中被發(fā)現(xiàn)作為一種致癌基因參與肺癌的發(fā)生發(fā)展,且通過針對特定腫瘤抑制因子進行抑制[4-5]。有研究在192例原發(fā)性結(jié)直腸癌標本中發(fā)現(xiàn)miR-31過表達可能參與原發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)展和進展[6]。但截至目前,臨床關(guān)于miRNA-31在NSCLC中的研究仍十分匱乏,且臨床研究稀少。本研究關(guān)注于血清中miR-31的表達與NSCLC的關(guān)系,以期發(fā)現(xiàn)血清miR-31作為NSCLC新的分子標志物的臨床價值。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    選擇我院及廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2017年1月~2019年1月NSCLC患者42例。納入標準:患者都經(jīng)由病理確診,符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)提出的《非小細胞肺癌指南》中的診斷及分期標準;術(shù)前未進行放療、化療等治療措施;術(shù)前血常規(guī)、肝腎功能正常者。排除標準:合并其他肺部疾病如間質(zhì)性肺炎;妊娠期或哺乳期患者。獲得上述患者的肺癌組織標本和癌旁組織標本,并抽取該42例患者和40例對照健康人群的外周血。42名患者年齡68.5±4.6歲,男性24名,女性18名;36例患者有吸煙史,6例不吸煙;其中I期18例,II期15例,III期9例。本次研究經(jīng)過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批后實施。

    1.2 標本處理

    規(guī)范收集新鮮切除手術(shù)標本,在離體后迅速放入凍存管,存入-80 ℃保存。術(shù)前1 d抽取外周血3~5 mL后置于EDTA抗凝管中,靜置30 min,4 ℃下1500 r/min離心20 min,取上層清亮血清至RNAse-free EP管中,置于-80 ℃保存。

    1.3 實驗流程

    1.3.1 總RNA的提取 肺癌組織和癌旁組織采取TRIzol試劑(Invitrogen公司)一步提取法,具體操作按照說明書進行。使用分光光度計測量RNA濃度和純度,取1 μg總RNA,100 V電壓下進行瓊脂糖凝膠電泳30 min,觀察RNA完整性。提取的總RNA分裝在EP管中,-80 ℃下保存。

    1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄 參照miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進行(試劑由銳博生物生產(chǎn))。反應(yīng)體系共15 μL(在7 μL逆轉(zhuǎn)錄混合液體系中加入5 μLRNA和3 μL逆轉(zhuǎn)錄引物)。反應(yīng)條件為42 ℃轉(zhuǎn)60 min,75 ℃i10 min。

    1.3.3 RT-PCR 采用TaqMan探針法,按照試劑盒說明書操作(北京晶典生物)。反應(yīng)體系包括cDNA 1 μL,2×PCR Master Mix 10 μL, Forward primer 1 μL,Reverse primer 1 μL,10×SYBER Green 0.5 μL,ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)條件為95 ℃反10 min,95 ℃i15 μL,60 ℃560 s,共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

    miRNA相對表達量用2-△△Ct法計算,所有數(shù)據(jù)利用SPSS19.0軟件處理,計數(shù)資料采用卡方檢驗,計量資料采用t檢驗或方差分析,ROC曲線分析miR-31對NSCLC的診斷效能。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 RT-PCR檢測miR-31的結(jié)果

    miR-31的擴增曲線呈S型,曲線平滑,溶解曲線為單峰,無雜峰信號,未出現(xiàn)非特異性擴增和污染(圖1)。

    圖1 miR-31的PCR結(jié)果

    2.2 miR-31在肺癌組織和癌旁組織中的表達

    miRNA在NSCLC組織中表達水平的2-△△Ct值為5.46±4.19,在相應(yīng)癌旁組織中為3.79±7.08。肺癌組織miR-31表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。

    2.3 miR-31表達與NSCLC臨床特征的相關(guān)性

    單因素分析結(jié)果表明,miR-31在NSCLC組織中的表達水平與臨床分期,是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),與年齡、病理類型、病理分級無關(guān)(P<0.05)。進一步多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),臨床分期和是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是miR-31 表達水平的獨立危險因素(表1、2)。

    2.4 miR-31

    在血清中的表達及組織和血清miR-31表達量的相關(guān)性miR-31在NSCLC患者中的血清表達水平為3.13±1.94,在正常人中的血清表達水平為1.23±2.28,NSCLC患者血清miR-31表達水平高于正常人(t=4.07,P=0.0001)。患者肺癌組織和血清中的miR-31的水平呈正相關(guān)(r=0.909,P=0.001,圖2)。

    表1 NSCLC組織中miR-31表達與臨床特征的單因素分析(Mean±SD)

    表2 NSCLC組織中miR-31表達與臨床特征的多因素分析

    圖2 組織miR-31和血清miR-31表達水平的相關(guān)性

    2.5 血清miR-31水平對NSCLC的診斷效能

    圖3 miR-31與NSCLC的ROC曲線

    通過ROC曲線得知,當曲線下面積最大時,面積為0.803,此時敏感性為0.829,特異性為0.763(圖3)。

    3 討論

    microRNAs已被確立為在肺癌發(fā)展,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和治療反應(yīng)等過程中具有相關(guān)作用的參與者[7-8]。在切除的腫瘤樣本或細針抽吸樣本中測量的miRNA已成為腫瘤診斷,預(yù)后和治療反應(yīng)預(yù)測的引人注目的生物標志物,因為它們易于檢測并且極端特異性[9]。痰、血漿、血清或全血中存在的miRNA越來越多地被探索為用于早期檢測癌癥的侵入性較小的生物標志物[10-12]。miRNA31是一種進化上保守的miRNA[13],位于人類染色體9q21.3上,并與CDKN2和IFNA家族的簇相鄰,是多種人類癌癥中基因組丟失的熱點[14]。目前,miR-31已被發(fā)現(xiàn)在包括乳腺癌[15]、肺癌[16-17]、結(jié)直腸癌[18]和成人T細胞白血病[14]等多種癌癥組織中表達異常。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),NSCLC組織miR-31顯著高于癌旁組織,NSCLC患者血清miRNA水平顯著高于正常人血清,表明miR-31參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展。有研究也同樣發(fā)現(xiàn)正常人體肺組織中miR-31中的3P、5P表達量均遠低于肺腺癌組織中的miR-31中3P、5P表達量[19],提示肺癌組織存在miR-31基因突變。有研究發(fā)現(xiàn)MET、PIK3C2A、GRB10等均為miR-31的直接靶基因[20],miR-31一方面能通過抑制多種腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因抑制腫瘤轉(zhuǎn)移過程,包括靶向抑制大腸癌中RASAl基因和乳腺癌中RhoA基因的表達;另一方面,miR-31作為致癌因子能通過抑制某些腫瘤抑制因子LATS2和PPP2R2A來抑制特定肺癌細胞的功能。但是,某個特定microRNA在腫瘤細胞中異常表達不一定會促進癌癥的發(fā)生和擴增,miR-31在NSCLC組織中的異常高表達可能是腫瘤表型的多種機制的綜合作用結(jié)果。研究結(jié)果顯示,NSCLC臨床分期、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響miR-31表達水平的獨立性危險因素,miR-31診斷NSCLC的敏感性0.829,特異性0.763,表明miR-31參與NSCLC疾病的進展,且針對NSCLC有較高的臨床診斷價值。

    本項研究關(guān)注miR-31對NSCLC診斷的價值,希望能發(fā)現(xiàn)NSCLC新的分子標志物,提高診斷的準確性,為病人提供更精細化的疾病管理。研究發(fā)現(xiàn)miR-31在NSCLC中表達上升,血清miR-31可以作為較好的監(jiān)測指標。但miR-31在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮什么樣的作用及其機制,仍需要更進一步的研究加以論證。

    [20]侯春英.MET-PI3K-Akt信號通路介導(dǎo)miRNA--31調(diào)控肺腺癌腫瘤干細胞功能[D].北京: 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2016.

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