梅毒的免疫學(xué)實驗診斷進展

陳銳, 鄭雅雯, 陳紅, 林麗蓉

廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院臨床檢驗中心 廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院傳染病研究所， 福建 廈門 361004

梅毒(syphilis)是一種性傳播疾病，在《中華人民共和國傳染病防治法》中被列為乙類防治病種，其病原體為梅毒螺旋體(Treponemapallidum，Tp)，屬蒼白密螺旋體蒼白亞種。近年來，梅毒的全球發(fā)病率和流行范圍不斷增加[1-2]。由于存在隱性感染和難以統(tǒng)計的私人診所接診患者，其真實發(fā)病率或遠高于目前所公布數(shù)據(jù)[3]。梅毒臨床表現(xiàn)復(fù)雜，其診斷在很大程度上依賴于實驗室檢查結(jié)果。實驗室檢查包括形態(tài)學(xué)檢查、分子生物學(xué)檢查和免疫學(xué)檢查。形態(tài)學(xué)檢測易受取材部位、取材方法等因素影響，靈敏度較低[4]，而分子生物學(xué)檢測Tp DNA對于一期或二期梅毒患者皮損有較高的靈敏度和特異性[4]，但對于較易獲得的血液樣本DNA檢測率低[5]，且國內(nèi)尚無已獲得醫(yī)療器械注冊證的檢測試劑。免疫學(xué)檢查是診斷梅毒的主要實驗室檢查方法[6-7]。本文就傳統(tǒng)免疫學(xué)實驗診斷在梅毒中的應(yīng)用及新免疫指標的進展作一綜述，重點闡述梅毒血清學(xué)試驗、梅毒細胞免疫學(xué)試驗和梅毒螺旋體抗原試驗進展，旨在為各級實驗室結(jié)合自身條件及臨床需求選擇合適的梅毒免疫學(xué)檢測方法提供依據(jù)。

1 梅毒血清學(xué)試驗

鑒于形態(tài)學(xué)檢查和分子生物學(xué)檢查的局限性，采用血清學(xué)試驗檢測抗體仍是實驗室檢測梅毒感染最常用的方法，包括梅毒非特異性抗體試驗和梅毒特異性抗體試驗。前者采用心磷脂-卵磷脂-膽固醇復(fù)合物抗原，檢測抗心磷脂的非特異性抗體；后者采用天然或重組的梅毒螺旋體抗原，檢測抗梅毒螺旋體成分的特異性抗體。

1.1 梅毒非特異性抗體試驗

此類試驗是基于Tp感染后宿主細胞釋放的類脂質(zhì)和Tp表面脂質(zhì)產(chǎn)生的非特異性抗體，即反應(yīng)素[8]。目前國內(nèi)外常用的梅毒非特異性抗體檢測方法包括性病研究實驗室試驗(venereal disease research laboratory，VDRL)、快速血漿反應(yīng)素試驗(rapid plasma reagin Test，RPR)和甲苯胺紅不加熱血清試驗(toluidine red unheated serum test，TRUST)等。在臨床應(yīng)用中，VDRL試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，對待測血清的新鮮度要求高且需要加熱滅活，而RPR和TRUST經(jīng)濟、方便、快捷[7]。最近，有一項薈萃分析[9]顯示VDRL對一期梅毒的敏感性為62.5%～78.4%，對二期梅毒的敏感性可達100%，對三期梅毒的敏感性為47%～64%；RPR對一期梅毒的敏感性為62.5%～76.1%，對二期梅毒的敏感性也可達到100%；TRUST的敏感性與RPR一致。可見，在不同研究中，三種方法的敏感性差異不大；在大多數(shù)情況下，RPR/TRUST可替代VDRL。因此，目前實驗室已很少使用VDRL，但其對神經(jīng)梅毒的檢查具有重要意義，我國2020 年梅毒診療指南指出在無條件做VDRL的情況下，可用RPR/TRUST替代[6]。

大量臨床數(shù)據(jù)顯示，該類試驗存在一定的生物學(xué)假陽性率，易受惡性腫瘤、蕁麻疹、皮炎、濕疹、腦梗塞、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、巨幼細胞性貧血、再生障礙性貧血、老年和妊娠等60多種生理或病理因素影響，即使通過重復(fù)試驗也無法避免[10]。此外，也存在前帶現(xiàn)象而造成漏檢。Liu等[11]通過對46 856例的梅毒血清RPR前帶現(xiàn)象研究，發(fā)現(xiàn)約31%前帶現(xiàn)象的滴度≤1 ∶16，即中度或較低抗體滴度也可能導(dǎo)致前帶現(xiàn)象，提示患者血清中的抗體過多并不是其發(fā)生的單一原因。此外，該項研究還顯示，前帶現(xiàn)象的出現(xiàn)與疾病的病程有關(guān)，特別是在梅毒孕婦及神經(jīng)梅毒患者中更易出現(xiàn)，其發(fā)生機制有待進一步研究。

值得注意的是，早期研究發(fā)現(xiàn)梅毒非特異性抗體滴度隨治療逐漸下降，梅毒患者治愈后其非特異性抗體滴度在6個月或12個月會有4倍或8倍的下降[12]，因此將非特異性抗體(如RPR)轉(zhuǎn)陰或4倍滴度下降作為療效監(jiān)測指標[7]，廣泛被臨床醫(yī)生接受，并被一些國內(nèi)外的指南推薦[6-7, 13]。然而，Lin等[14]采用兔感染模型，發(fā)現(xiàn)感染兔無論是否治療，其RPR的變化趨勢相似，都存在4倍下降或轉(zhuǎn)陰的可能，且感染兔治療后RPR滴度下降4倍甚至轉(zhuǎn)陰后，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)種依然能感染新的兔子，提示梅毒非特異性抗體作為療效監(jiān)測指標值得商榷。尋找有效的梅毒治療監(jiān)測指標將成為梅毒研究的熱點。

1.2 梅毒特異性抗體試驗

人體感染Tp后產(chǎn)生IgM和IgG抗體。IgM抗體在感染后2～4周產(chǎn)生，常作為梅毒早期感染并活動的一項免疫學(xué)指標；IgG抗體在IgM抗體產(chǎn)生后兩周出現(xiàn)，反映梅毒感染病史，是梅毒流行病學(xué)調(diào)查的重要依據(jù)。與梅毒非特異性抗體試驗相比，梅毒特異性抗體試驗具有較高的敏感性和特異性。特異性抗體的生物學(xué)假陽性罕見，偶爾可出現(xiàn)于腫瘤、免疫異常、病毒性肝炎和糖尿病患者中[15]。需要注意的是，此類試驗的陽性結(jié)果可能持續(xù)較長時間，甚至終生，因此不被推薦用于評價梅毒的療效[7]。目前國內(nèi)外常用的梅毒特異性抗體檢測方法包括梅毒螺旋體明膠凝集試驗(Treponemapallidumparticle assay，TPPA)、梅毒螺旋體熒光抗體吸收試驗(fluorescent treponemal antibody-absorbed，F(xiàn)TA-ABS)、梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(Treponemapallidumenzyme linked immunosorbent assay，TP-ELISA)、梅毒螺旋體化學(xué)發(fā)光免疫分析(Treponemapallidumchemiluminescence analysis，TP-CLIA)和梅毒螺旋體免疫印跡試驗(Treponemapallidumwestern blot，TP-WB)等。

由于梅毒螺旋體血凝試驗(Treponemapallidumhaemagglutination assay, TPHA)對一期梅毒的檢測效能不佳，常發(fā)生自凝現(xiàn)象，假陽性率較高[16]，現(xiàn)已被其改良方法TPPA替代。TPPA在試劑制備過程中排除了多種非特異性干擾，對各期梅毒的敏感性達84.5%～100%，特異性達94.0%～100%[16]，是目前全球范圍內(nèi)廣泛被認可和應(yīng)用的梅毒篩查試驗或確證試驗方法[17]。FTA-ABS排除了同屬抗原交叉反應(yīng)的可能，且利用的是完整的Tp進行檢測，對各期梅毒的敏感性為78.2%～100%，特異性為92.0%～100%[16]，但操作復(fù)雜且對操作者要求高。TP-WB采用多種高度純化的重組Tp抗原，具有較高特異性和敏感性，但其存在成本昂貴、結(jié)果顯示不明確等局限性[7]。有文獻指出，TP-WB法檢測正常人、抗核抗體陽性、類風(fēng)濕因子陽性和其它螺旋體感染的患者血清標本均為陰性反應(yīng)，提示其生物學(xué)假陽性較低[18]。此外，TP-WB法檢測TP-IgM抗體時，不受IgG抗體存在的影響，是診斷先天梅毒的良好試驗。但此三者均存在成本較高、操作相對繁瑣和不易實現(xiàn)自動化等局限性，很難在臨床上全面推廣和應(yīng)用，可作為有條件的實驗室的補充實驗。

TP-ELISA/CLIA較好解決了應(yīng)用受限的問題。有文獻指出，TP-ELISA對各期梅毒的敏感性為98.56%，特異性為99.77%；其純化的基因重組抗原提高了試驗的特異性，酶的放大效應(yīng)提高了試驗的靈敏度[19]。該方法由檢驗儀器自動化操作，結(jié)果客觀準確，適合大規(guī)模梅毒篩查；但不同廠家的試劑盒質(zhì)量參差不齊，臨床使用前應(yīng)對其進行評估。研究表明[20]，TP-CLIA 檢測各期梅毒特異性抗體的敏感性和特異性均在99%以上，已經(jīng)成為國外檢測梅毒特異性抗體的主要方法，國內(nèi)也逐年增加應(yīng)用，可作為大規(guī)模梅毒特異性抗體檢測首選篩查試驗[21]。但也有報道顯示，TP-CLIA與TPPA的檢測結(jié)果存在不一致性，TP-CLIA檢測早期或隱性梅毒抗體的敏感性較TPPA高，但前者在檢測特異性方面存在一些問題，即TP-CLIA篩查出的弱陽性標本，復(fù)查TPPA為陰性結(jié)果[22]，因此實驗室需根據(jù)自身情況，驗證試劑廠家提供的灰區(qū)范圍甚至制訂最佳臨界值。在此基礎(chǔ)上建立起來的微粒子化學(xué)發(fā)光免疫法(CMIA)是近年來應(yīng)用于檢測梅毒特異性抗體的一項新技術(shù)，自動化程度高，檢測簡捷，有潛在的應(yīng)用前景。以上三種檢測技術(shù)檢測的是Tp總抗體，即不區(qū)分Ig G/M，不適用于新生兒的梅毒特異性抗體檢測，不利于先天梅毒的早期診斷。鑒于此，IgM捕捉ELISA法是其良好的補充試驗。值得注意的是，若感染時間較長，體內(nèi)TP-IgM抗體可能降低到檢測限以下，因此單用TP-IgM抗體診斷隱性梅毒易出現(xiàn)漏診，必須結(jié)合RPR及TPPA結(jié)果。

1.3 梅毒血清學(xué)臨床應(yīng)用策略

鑒于存在梅毒感染窗口期和不同檢測方法的局限性等因素，使用單一血清學(xué)方法進行篩查和(或)診斷，均存在漏檢或誤檢的可能，需要應(yīng)用兩種及以上的試驗來完成確認，即實驗診斷程序(或策略)，包括傳統(tǒng)、逆序和第三種診斷程序。

傳統(tǒng)實驗診斷程序是以非特異性抗體試驗(如RPR)作為初篩試驗，特異性抗體試驗作為確認試驗[23]。原則上，篩查試驗應(yīng)追求無限的靈敏度，允許一定量假陽性，但應(yīng)盡可能減少假陰性結(jié)果。如前所述，梅毒非特異性抗體試驗的敏感性受感染階段和檢測時間等影響，較特異性抗體試驗低，且存在前帶現(xiàn)象，不宜作為篩查指標。因此，美國性傳播疾病治療指南(2015版)推薦有條件的臨床實驗室應(yīng)用逆序?qū)嶒炘\斷程序[24]。

逆序?qū)嶒炘\斷程序是采用特異性抗體試驗作為初篩試驗，而非特異性抗體試驗作為確認試驗。當二者結(jié)果不一致時，再以第2種不同的特異性抗體試驗進行判定[23]。不可否認，此法相較于傳統(tǒng)實驗診斷程序來說具有更高的靈敏度和特異性，且更易實現(xiàn)自動化和高通量檢測；但特異性抗體陽性的患者，其非特異性抗體不一定陽性。因此，在實驗診斷中，特異性抗體初篩后，再以非特異性抗體進行確認，可能是不必要的檢查。

針對上述問題，Tong等[25]提出第三種實驗診斷程序，即以梅毒特異性抗體試驗(如TP-CLIA或TP-ELISA)作為初篩試驗，第2種不同的梅毒特異性抗體試驗作為確認試驗。該文獻通過對24 124例篩查患者的橫斷面調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)此診斷程序的診斷準確性高達99.93%，與逆序診斷程序的一致性為99.9%，都有較高的診斷效能，但節(jié)省了反應(yīng)素檢測的環(huán)節(jié)，并有效地杜絕了反應(yīng)素檢測的生物學(xué)假陽性和前帶現(xiàn)象。值得一提的是，該方案已被歐洲梅毒管理指南(2020版)和加拿大公共衛(wèi)生實驗室指南(2015版)所推薦[7, 13]。

2 神經(jīng)梅毒的免疫學(xué)檢測

近年來，隨著對梅毒免疫學(xué)的深入研究，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)梅毒疾病進展與患者細胞免疫間有著密切的聯(lián)系。在惡性梅毒和嚴重的神經(jīng)梅毒等情況下表現(xiàn)出CD4+、NK和CD4+/CD8+比值下降，CD8+升高以及IL-2、TNF、IFN等Th1型細胞因子分泌減少和IL-4、IL-6等Th2型細胞因子大量產(chǎn)生[26]。因此，這類感染指標適用于疾病嚴重程度的評估及進展的監(jiān)測。有研究發(fā)現(xiàn)Th17細胞以及IL-17在梅毒患者外周血中高度表達，對疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要作用[27]。此外，腦脊液中趨化因子配體CXCL-13的濃度升高可作為神經(jīng)梅毒的參考診斷依據(jù)[6]。

值得注意的是，從臨床數(shù)據(jù)和動物實驗中均發(fā)現(xiàn)免疫細胞因子的變化對梅毒的診斷具有一定參考價值。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)或可作為HIV陰性神經(jīng)梅毒患者的腦脊液(CSF)標志物，該研究發(fā)現(xiàn)CSF-MIF在神經(jīng)梅毒診斷中的敏感性為74.42%，甚至高于CSF-RPR(39.53%)、CSF蛋白水平異常(48.84%)和CSF白細胞增多(67.44%)[28]。總之，免疫細胞和細胞因子有望成為梅毒診斷新的生物標志物。

3 梅毒螺旋體抗原試驗

抗原作為病原體的組成部分，出現(xiàn)時間較早，檢測不受機體免疫效應(yīng)的影響，有些抗原的多少與病原體的存活狀態(tài)密切相關(guān)。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，涌現(xiàn)出新的梅毒重組蛋白如感染依賴性抗原、黏附蛋白和鞭毛蛋白等[29]。Liu等[30]利用兔感染模型發(fā)現(xiàn)Tp感染依賴性抗原(Tp0971、Tp0768)對早期梅毒和潛伏感染的診斷具有重要意義。Jiang等[31]研究發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白Tp0463在先天梅毒中表現(xiàn)出良好的診斷價值。外膜蛋白Tp1038、Tp0868和Tp0965也被證實對晚期梅毒和隱性梅毒有良好檢出率[32]，其中Tp0965對血清學(xué)反應(yīng)的敏感性為98.8%，特異性為87.5%，并且在各期梅毒患者診斷的靈敏度和特異性均較高[32]。這為梅毒診斷提供新思路，即針對Tp在不同感染時期形成的蛋白表達譜不同的特點，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(如Label-free質(zhì)譜法結(jié)合免疫印跡)，檢測不同感染階段所表達的抗原或以其作為該階段的標志物檢測相應(yīng)的抗體，對梅毒感染的分期具有重大意義，因此該類檢測的發(fā)展前景良好。另外，可通過蛋白質(zhì)芯片技術(shù)高通量檢測Tp抗原物質(zhì)，具有潛在的前景。

4 結(jié)語與展望

梅毒被稱為偉大的模仿者[33]，不能僅根據(jù)流行病史和臨床表現(xiàn)而確認，梅毒實驗室檢測在梅毒診斷中占重要地位。Tp尚不能在體外進行長時間培養(yǎng)，病原體的形態(tài)學(xué)檢查受樣本取材等限制，靈敏度低。Tp感染后所產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，成為確定Tp感染的重要依據(jù)。梅毒的免疫學(xué)實驗診斷除了已納入指南的梅毒血清學(xué)試驗外，還包括近年來研究發(fā)現(xiàn)的新的梅毒標志物，如免疫細胞分群、免疫細胞分泌的細胞因子(IL-17、CXCL-13和MIF等)和Tp抗原等。完善傳統(tǒng)的免疫學(xué)檢測試驗、開展新的免疫學(xué)感染指標研究和探索潛在的免疫診斷標志物對各期梅毒的診斷及其療效判斷具有重大意義。