SOD1突變及其介導(dǎo)的線粒體異常在肌萎縮側(cè)索硬化癥中的研究進(jìn)展

羅紅梅，陳紅

肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種多致病性神經(jīng)退行性疾病，同時(shí)累計(jì)上下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的肌無力與呼吸衰竭，從發(fā)病至死亡僅經(jīng)2～5年[1]。ALS普遍分為散發(fā)性ALS(sALS)與家族性ALS(fALS)，sALS占90%，剩余10%的fALS與50多個(gè)基因相關(guān)[2-3]。其中銅鋅超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1，SOD1)，C9orf72中的突變，肉瘤融合基因，TAR DNA結(jié)合蛋白43(TAR DNA binding protein 43，TDP-43)和其他一些病例占fALS的50%～70%，并且相同突變也出現(xiàn)在sALS病例中。因此，基因研究對我們了解該病的病理機(jī)制非常重要。目前，該病潛在的病理機(jī)制并未完全研究透徹，但現(xiàn)已知引起ALS的病因包括：谷氨酸介導(dǎo)的興奮性毒性、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、RNA信號(hào)異常、軸突運(yùn)輸障礙等。目前批準(zhǔn)用于臨床的藥物有利魯唑[4]和依達(dá)拉奉[5]，然而都沒有達(dá)到令人滿意的效果[6]。在此，我們回顧了SOD1的突變以及其對周圍環(huán)境產(chǎn)生的影響，描述了突變SOD1如何介導(dǎo)線粒體功能障礙導(dǎo)致ALS，并考慮針對突變SOD1介導(dǎo)的病理機(jī)制是否能夠研發(fā)新的藥物來阻斷其致病途徑，有效延緩疾病發(fā)展。

1 SOD1的正常生理作用與突變產(chǎn)生的影響

SOD1是一種抗氧化劑[7]，存在于細(xì)胞質(zhì)、線粒體的膜間空間、過氧化物酶體、真核生物的細(xì)胞外空間以及某些原核生物的周質(zhì)中[8]。早期文獻(xiàn)報(bào)道SOD1是由兩個(gè)相互作用強(qiáng)的亞基組成的二聚體，兩亞基由二硫鍵連接，整個(gè)SOD1蛋白具有豐富的β折疊，并與銅離子、鋅離子結(jié)合，起著將高反應(yīng)性活性氧—超氧化物轉(zhuǎn)換為氧分子和過氧化氫的重要作用[9-11]。ALS患者體內(nèi)編碼SOD1的基因發(fā)生突變，錯(cuò)誤折疊的突變型SOD1會(huì)在脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中積累，產(chǎn)生的細(xì)胞毒性使運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性死亡。目前已知人類SOD1相關(guān)突變有180多種[12]，盡管人們一直在做研究，但ALS的根本原因仍然是個(gè)未解之謎。

正常SOD1為了成熟為活性酶，在二硫鍵還原，未完成金屬化的狀態(tài)下進(jìn)入線粒體膜間隙(intermembrane space，IMS)，隨后在銅分子伴侶(copper chaperone for SOD1，CCS)的催化下進(jìn)行翻譯后修飾：鋅和銅的插入，分子內(nèi)二硫鍵的形成和二聚化，成熟的SOD1得以保留在IMS中[13]。活性氧(reactive oxygen species， ROS)由細(xì)胞正常代謝產(chǎn)生，是線粒體呼吸鏈復(fù)合物中發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的旁路產(chǎn)物(主要是復(fù)合物I和復(fù)合物III)[14]。功能成熟的SOD1將超氧陰離子歧化為H2O2，后者再被過氧化氫酶，谷胱甘肽過氧化物酶或過氧環(huán)氧酶進(jìn)一步還原為H2O[15]。在線粒體應(yīng)激條件下，SOD1活性的顯著提高可能導(dǎo)致IMS 中ROS和H2O2產(chǎn)生增加，H2O2被細(xì)胞色素C催化生成高反應(yīng)性氧化劑oxoferryl-CytC(CytCFe 4+)，引起線粒體功能障礙，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑[16]。而經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明SOD1 G93A小鼠的脊髓IMS制劑的SOD1活性是野生型小鼠的6倍，說明SOD1突變后歧化酶活性增加以及ROS產(chǎn)生升高[17]。

2 突變SOD1介導(dǎo)的線粒體異常

線粒體在細(xì)胞代謝與存活方面發(fā)揮著重要作用。線粒體除了能夠產(chǎn)生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)為細(xì)胞供能之外，在磷脂的生物發(fā)生，鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡中也起著重要的作用。線粒體腫脹與液泡化是ALS運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中最早觀察到的病理特征之一[18]，在ALS發(fā)作之前已經(jīng)觀察到突變SOD1在線粒體中積累[19]，這是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的標(biāo)志之一。目前普遍認(rèn)為突變SOD1有兩個(gè)主要的線粒體定位：IMS和線粒體外膜(oter mitochondrial membrane，OMM)。突變SOD1通過線粒體外膜蛋白進(jìn)入IMS，并沉積在IMS中積累的不溶性聚集體中，從而掩蓋CCS的活性。然而，Chen等[20]發(fā)現(xiàn)在人ALS 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中SOD1 的聚集和線粒體的腫脹并不明顯，可能是由于人ALS神經(jīng)元中SOD1的水平相對較低。此外，突變SOD1可能沉積在OMM上，從而干擾跨線粒體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)并參與線粒體細(xì)胞凋亡[19]。

2.1 突變SOD1與線粒體外膜 B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)是一種線粒體外膜上的抗凋亡蛋白，Bcl-2家族成員通過同二聚化，與同一家族中的蛋白質(zhì)異二聚化或與其他蛋白質(zhì)伴侶結(jié)合來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[21]。在表達(dá)G93A突變的轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中發(fā)現(xiàn)了促凋亡的蛋白BCL-2同源的水溶性相關(guān)蛋白(Bcl2-associated X，Bax)和B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)啟動(dòng)子(Bcl-2 associated death promoter，BAD)表達(dá)增加，而抗凋亡的Bcl-2表達(dá)減少[22]。SOD1突變體與Bcl-2結(jié)合，導(dǎo)致Bcl-2的構(gòu)象發(fā)生變化，暴露出對線粒體有毒的BH3結(jié)構(gòu)域，引起細(xì)胞色素c釋放，啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡程序，伴隨線粒體形態(tài)改變：線粒體腫脹，廣泛空泡化以及cr斷裂。不僅如此，新暴露的BH3結(jié)構(gòu)域可能與谷胱甘肽結(jié)合，抑制其抗氧化特性[23]。Bcl-2的構(gòu)象與表型改變，不僅失去了其自身在細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡作用，還與突變SOD1一起對線粒體功能造成損害。電壓依賴性陰離子通道(voltage dependent anion channel 1，VDAC1)是一種線粒體孔蛋白，能調(diào)節(jié)線粒體呼吸作用并且調(diào)節(jié)ATP經(jīng)線粒體外膜流出至細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)也調(diào)控二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)進(jìn)入線粒體進(jìn)行氧化磷酸化[24]。有研究表明突變SOD1能夠直接抑制VDAC1的傳導(dǎo)，從而降低細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ADP/ATP的比值和線粒體膜電位，造成線粒體功能障礙[25]。而這一種說法引起爭論，Tan等[26]通過實(shí)驗(yàn)證明錯(cuò)誤折疊的突變SOD1并非直接結(jié)合VDAC1，而是通過Bcl-2來使得VDAC1的電導(dǎo)下降。其中也可能存在突變SOD1同時(shí)結(jié)合Bcl-2與VDAC1而對線粒體產(chǎn)生毒害作用，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證明。但能夠肯定的是，無論是突變SOD1直接與VDAC1或間接通過Bcl-2作用而導(dǎo)致的VDAC1 電導(dǎo)降低，導(dǎo)致線粒體對ADP的通透性降低，能量產(chǎn)生減少并導(dǎo)致氧化應(yīng)激，最終使線粒體發(fā)生超極化，細(xì)胞活性下降導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2.2 突變SOD1與線粒體動(dòng)力學(xué) 線粒體根據(jù)需要不斷融合與裂變來維持自身的功能。功能受損的線粒體可通過與健康的線粒體融合來減少對細(xì)胞的傷害[27]，同時(shí)細(xì)胞也可利用線粒體裂變來分離受損嚴(yán)重的線粒體使其被降解[28]。早期就已經(jīng)在ALS患者以及突變SOD1細(xì)胞培養(yǎng)、小鼠模型中發(fā)現(xiàn)線粒體形態(tài)以及超微結(jié)構(gòu)異常，線粒體片段化增加[29-31]。線粒體分裂和融合的調(diào)控由鳥苷三磷酸酶(GTPases)的協(xié)同作用控制，控制線粒體裂變的蛋白是與動(dòng)力蛋白有關(guān)的蛋白[32]；控制線粒體融合的蛋白則為線粒體融合蛋白1，2和視神經(jīng)萎縮蛋白1(optical atrophy-1，OPA1)，前者控制線粒體外膜融合，后者控制內(nèi)膜融合[33]。在培養(yǎng)的表達(dá)SOD1 G93A的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell-34，NSC-34)中，OPA1水平的減少和動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，DRP1)的水平升高導(dǎo)致了線粒體網(wǎng)絡(luò)斷裂[34]。Glutaredoxin 2的過表達(dá)通過恢復(fù)DRP1和OPA1的水平來恢復(fù)線粒體的正常功能和動(dòng)力學(xué)，并阻止神經(jīng)元凋亡[34]。同樣的，在表達(dá)SOD1 G93A的小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)線粒體裂變與融合的比例增加，通過外源性表達(dá)線粒體去乙?；负娃D(zhuǎn)錄共激活因子阻止了突變SOD1 G93A的線粒體片段化和神經(jīng)元細(xì)胞死亡[35]。突變SOD1為何會(huì)導(dǎo)致線粒體分裂與融合的相關(guān)蛋白表達(dá)水平失調(diào)目前尚不清楚。已知線粒體的融合受損會(huì)導(dǎo)致線粒體DNA位點(diǎn)突變或缺失，導(dǎo)致功能異常的線粒體在神經(jīng)元中積累[30]。線粒體分裂異常會(huì)影響自噬清除受損線粒體過程[28]?？偠灾?，線粒體的動(dòng)力學(xué)改變均會(huì)影響到神經(jīng)元的正常功能，甚至引起神經(jīng)元變性死亡。線粒體在胞體與特定細(xì)胞位置例如突觸之間的軸突運(yùn)輸供能對神經(jīng)元功能和存活至關(guān)重要。在表達(dá)SOD1 G93A小鼠首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)軸突線粒體運(yùn)輸存在缺陷，而后在表達(dá)突變SOD1的NSC-34運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中也發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸缺陷[36-37]。在神經(jīng)元中驅(qū)動(dòng)蛋白負(fù)責(zé)順行運(yùn)輸，動(dòng)力蛋白負(fù)責(zé)逆行運(yùn)輸，它們與適配器蛋白和膜受體蛋白相互作用，以驅(qū)動(dòng)軸突運(yùn)輸。Moller等[38]用實(shí)驗(yàn)證明了ALS突變SOD1通過誘導(dǎo)磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)誘導(dǎo)的激酶1(PTEN-induced kinase 1，PINK1)/泛素連接酶(PARKIN)信號(hào)通路且不依賴細(xì)胞鈣水平來降低膜受體蛋白的水平，從而導(dǎo)致神經(jīng)元中線粒體逆行軸突運(yùn)輸受損，而其中的導(dǎo)火索可能是突變SOD1引起的線粒體損傷誘導(dǎo)了PINK1磷酸化作用及后續(xù)的吞噬過程。突變SOD1引起神經(jīng)元線粒體軸突運(yùn)輸障礙的原因有很多[39-41]，包括突變SOD1在線粒體中聚集導(dǎo)致ATP生成減少，妨礙軸突運(yùn)輸；突變SOD1與動(dòng)力蛋白復(fù)合體相互作用形成聚集體影響軸突運(yùn)輸?shù)?。各種途徑導(dǎo)致的遠(yuǎn)端軸突運(yùn)輸障礙退化最終會(huì)引起神經(jīng)元的死亡，這符合提出的“垂死”假說，盡管后來這一假說受到了挑戰(zhàn)[42]。

2.3 突變SOD1與線粒體自噬 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元再生能力低，需要通過自噬來清除錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)或者受損的線粒體來保持自身的穩(wěn)態(tài)以及正常功能[43]。在ALS中自噬參與的標(biāo)志之一是自噬小體在ALS患者脊髓神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中的積累[44]。正常情況下，在線粒體中發(fā)生選擇性自噬，自噬受體在TANK結(jié)合激酶1(TANK binding kinase，TBK1)的作用下翻譯后修飾，增強(qiáng)了受體與泛素化底物(通常為受損線粒體和應(yīng)激顆粒和SOD1突變聚集體)或細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3的結(jié)合，隨后自噬泡開始形成并擴(kuò)展形成自噬體，最終，自噬體與溶酶體融合，內(nèi)容物被降解[45]。當(dāng)編碼自噬相關(guān)蛋白的基因出現(xiàn)了突變或其中的某一個(gè)環(huán)節(jié)被阻斷，都有可能導(dǎo)致ALS。有證據(jù)表明在表達(dá)SOD1 G93A突變的ALS小鼠脊髓中出現(xiàn)自噬受體特異性聚集[46]，在無癥狀早期階段脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元出現(xiàn)特征性溶酶體缺陷，均導(dǎo)致了后續(xù)的自噬失調(diào)，且后者出現(xiàn)溶酶體的逆行運(yùn)輸障礙[47]。由于突變的SOD1G93A與囊泡融合相關(guān)蛋白Snapin競爭性結(jié)合動(dòng)力蛋白中間鏈(dynein intermediate chain，DIC)，干擾Snapin-DIC介導(dǎo)的動(dòng)力蛋白向后期核內(nèi)體的動(dòng)力蛋白募集，從而減少它們在人SOD1 G93A 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的逆行轉(zhuǎn)運(yùn)，因此而降低了溶酶體運(yùn)輸，造成自噬缺陷[47]。這表明軸突運(yùn)輸與自噬功能相互影響。同時(shí)，在表達(dá)SOD1突變的ALS轉(zhuǎn)基因小鼠和NSC-34細(xì)胞模型中控制溶酶體生物合成的轉(zhuǎn)錄因子EB(transcription factor EB，TFEB)的水平發(fā)生了改變， 由TFEB介導(dǎo)的自噬相關(guān)基因Beclin-1 mRNA和蛋白水平也出現(xiàn)了相同的改變，這一級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的自噬改變可能是ALS發(fā)病機(jī)理中的關(guān)鍵因素[48]。文中也提出TFEB的過表達(dá)促進(jìn)了體外自噬，最終延長細(xì)胞存活[48]?？偠灾?，ALS中不同途徑之間存在相互聯(lián)系，其他途徑很可能直接或間接影響自噬，反之亦然。神經(jīng)元中相互作用的機(jī)制以及編碼蛋白基因的突變也會(huì)導(dǎo)致ALS中的自噬失調(diào)。因此，針對自噬失調(diào)提出的新策略可能是治療ALS的新方法。

3 ALS的治療對策

3.1 基因治療 盡管目前臨床并未出現(xiàn)針對ALS的有效藥物，但人們在探索ALS治療對策的道路上從未止步。近年來人們將治療重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了基因治療，通過向ALS SOD1突變小鼠的脊髓軟膜下注射腺相關(guān)病毒-短發(fā)夾RNA來沉默SOD1基因的表達(dá)，從而延緩疾病進(jìn)展，阻止運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的退化，尤其在小鼠癥狀前階段注射效果達(dá)到最好[49]。也有基于非載體的鞘內(nèi)遞送反義寡核苷酸降低脊髓SOD1 mRNA和蛋白的濃度，延長了ALS SOD1突變大鼠的生存期，并且該方法在臨床的第一階段安全性與耐受性良好[50]。在臨床試驗(yàn)中，Mueller等[51]通過向病人鞘內(nèi)注射AAV抑制SOD1的蛋白合成；Miller等[52]則向病人鞘內(nèi)注射反義寡核苷酸來介導(dǎo)SOD1 mRNA的降解；但以上臨床試驗(yàn)均面臨著樣本量少，試驗(yàn)周期長，嚴(yán)重的不良反應(yīng)等巨大阻力，多種因素導(dǎo)致最終療效并不明顯，因此并未得出基因治療療效的確定性結(jié)論。因此，我們需要多階段重復(fù)試驗(yàn)來驗(yàn)證前人所取得的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲取有效治療靶點(diǎn)并將基因療法成熟應(yīng)用與臨床中，及早為備受煎熬的ALS患者帶去曙光。

3.2 康復(fù)治療 康復(fù)治療可以幫助病患者發(fā)揮他們最大的潛力，讓他們盡可能獨(dú)立和安全地日常生活。ALS患者大多因呼吸困難死亡，因此需定期對患者進(jìn)行肺功能評估，呼吸肌訓(xùn)練能夠提高呼吸肌肌力，改善患者的通氣功能[53]；在嚴(yán)格監(jiān)控下的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠延緩ALS損害患者的運(yùn)動(dòng)功能[54]；言語治療與康復(fù)護(hù)理能夠改善患者后期的構(gòu)音障礙以及生活質(zhì)量。ALS患者需要多學(xué)科交叉的綜合康復(fù)治療，才能最大程度地保留患者的殘存功能，從而減少患者心理與生理的痛苦，提高生活質(zhì)量。

4 討論

SOD1突變是ALS中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的基因突變，從結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，導(dǎo)致折疊錯(cuò)誤和聚集體形成已經(jīng)被廣泛研究，其介導(dǎo)的線粒體功能障礙已經(jīng)是ALS早期病理標(biāo)志之一。線粒體障礙繼發(fā)引起ROS產(chǎn)生，氧化應(yīng)激又加劇了SOD1的突變與錯(cuò)誤折疊，如此形成惡性循環(huán)。由于復(fù)雜的致病機(jī)制，缺乏有效的治療靶點(diǎn)，盡管出現(xiàn)新興的基因治療策略，但還未在臨床中成功應(yīng)用，康復(fù)能夠在一定程度上減輕患者功能障礙，但不能從根本上阻止ALS病程，因此ALS仍然是最嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病之一。ALS各信號(hào)途徑的互相串?dāng)_既為我們探明其發(fā)病機(jī)理增加了難度，又為我們研究ALS治療策略提供新的方向。隨著越來越多ALS相關(guān)研究的開展，人們最終會(huì)解開這一棘手的神經(jīng)退行性疾病的神秘面紗。