大別山牛Y-SNPs和Y-STRs遺傳多樣性及父系起源研究

李芳玉，夏小婷，賈玉堂，黨瑞華，陳 宏，雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技系統(tǒng)，陜西 楊凌 712100；2.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，安徽 合肥 230031)

中國黃牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛，起源上包括普通牛和瘤牛兩個牛種，二者的共同祖先是原牛[1]。作為世界牛品種資源寶庫的重要組成部分，我國地方黃牛品種具有豐富的遺傳多樣性。1986年，邱懷[2]在《中國牛品種志》將中國地方黃牛品種按照地理分布區(qū)域的不同，把中國黃牛分為北方黃牛、中原黃牛和南方黃牛3大類。大別山牛以分布在大別山而定名，是南方黃牛代表品種之一，屬于役肉兼用型牛。主要產(chǎn)區(qū)為湖北省大別山西部的黃陂﹑大悟﹑英山﹑羅田﹑紅安﹑麻城和安徽省大別山東部的金寨﹑岳西﹑六安﹑舒城﹑桐城﹑潛山﹑太湖﹑宿松等縣。大別山牛具有適應(yīng)性好、抗病力強、耐粗飼等優(yōu)點，對高溫、高濕和寒冷具有較強的耐受性，經(jīng)改良后雜交優(yōu)勢明顯，是我國優(yōu)良地方品種之一。 Y染色體由雄性特異區(qū)(MSY)和擬常染色體區(qū)(PAR)兩部分組成，其中MSY區(qū)在減數(shù)分裂時不與X染色體發(fā)生重組，具有父系遺傳特性，且Y染色體的單倍型完整，具有較低的突變率，不易受重組和回復(fù)突變等因素影響，是探明父系遺傳多樣性、起源和馴化歷史等研究的理想工具[3]。利用位于Y染色體MSY區(qū)的單核苷酸多態(tài)性(Y-SNPs)和微衛(wèi)星(Y-STRs)標(biāo)記可以確定牛的Y染色體單倍型組(即普通牛Y1和Y2單倍型組，瘤牛Y3單倍型組)，對闡明家牛的遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)以及父系起源歷史發(fā)揮了重要作用。根據(jù)以往的一些研究表明[1,4]，利用Y-SNPs可以區(qū)分Y1、Y2和Y3三種單倍型組，而利用Y-STRs可以更精細(xì)地區(qū)分每個單倍型組中豐富的單倍型。 常振華等[4]基于Y-SNPs標(biāo)記(DDX3Y-7、UTY-19、ZFY-9和ZFY-10)和 Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)對16個中國地方黃牛品種284頭公牛進(jìn)行了父系遺傳多樣性及起源分析，結(jié)果在16個黃牛品種中僅發(fā)現(xiàn)普通牛Y2和瘤牛Y3單倍型組，未檢測到普通牛Y1單倍型組，得出結(jié)論為中國黃牛存在普通牛Y2和瘤牛Y3兩種父系起源，普通牛在北方占優(yōu)勢，瘤牛主要分布在南方，中原地區(qū)為二者交匯處。但是其研究并未涉及到大別山牛。本研究利用2個Y-SNPs標(biāo)記UTY-19和ZFY-10及2個Y-STRs標(biāo)記INRA189和BM861對49頭大別山牛公牛進(jìn)行多態(tài)性檢測，通過分析大別山牛Y染色體的單倍型組成，來探明該品種的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及父系起源。

1 材料與方法

1.1 采樣及基因組DNA提取

在安徽省太湖縣大別山牛保種場采集大別山牛公牛的耳組織低溫保存帶回實驗室，常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，稀釋濃度至10～20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴(kuò)增

參照G?therstr?m等[5]和Ginja等[6]報道的2個家牛Y-SNPs標(biāo)記(即UTY-19和ZFY-10)以及Edwards等[7]的研究中的Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)合成四對引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 家牛2個Y-SNPs位點及2個Y-STRs位點的名稱、位置、退火溫度與引物序列

25 μL PCR體系：2×PrimeSTAR Max Premix (上海寶生物公司)10.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超純水12.5 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃變性10 s，X℃(表1)退火15 s，72℃延伸10 s，35個循環(huán)，后冷卻至4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠(含 GoldView 核酸染料)電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。

1.3 測序、單倍型組分型及單倍型頻率計算

將Y-SNPs標(biāo)記的PCR純化產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司，用3730XL型DNA測序儀(Applied Biosystems公司)進(jìn)行正、反向測序，測序結(jié)果用Chromas 2.3軟件進(jìn)行查看和校正，得到每頭大別山牛公牛的2個Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)測序序列。2個Y-STRs標(biāo)記的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行熒光分型，獲得INRA189和BM861的等位基因大小。根據(jù)Y-SNPs標(biāo)記和Y-STRs標(biāo)記的數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，獲得大別山牛公牛的單倍型，再用Arlequin 3.0軟件進(jìn)行單倍型多樣度計算。

2 結(jié)果與分析

通過對49頭大別山牛公牛的2個Y-SNPs(UTY-19和ZFY-10)標(biāo)記的測序分析以及參考G?therstr?m等[5]和Ginja等[6]對家牛Y染色體單倍型組的判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明：這2個Y-SNPs標(biāo)記在49頭大別山牛中均沒有多態(tài)性，與G?therstr?m等[5]對家牛Y1、Y2、Y3單倍型組的判定標(biāo)準(zhǔn)相比，其中UTY-19標(biāo)記發(fā)現(xiàn)一個對應(yīng)的A 堿基，在ZFY-10標(biāo)記發(fā)現(xiàn)1個對應(yīng)的T堿基和1個GT插入/缺失，表明49頭大別山牛只包含Y3一種單倍型組(表2)。對49頭大別山牛公牛的2個Y-STRs(INRA189和BM861)標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示，INRA189只有一個等位基因，大小為88 bp，而BM861也只有一個大小為156 bp的等位基因。〗結(jié)合Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記確定大別山牛的單倍型為Y3-88-156(表2)，說明大別山牛只有一個瘤牛父系起源。大別山牛的單倍型多樣度為0，說明其父系遺傳多樣性很低，遺傳基礎(chǔ)非常穩(wěn)定。

表2 大別山牛的Y染色體單倍型

3 討論

利用Y-SNPs標(biāo)記可以判斷家牛的Y1、Y2和Y3單倍型組，而Y-STRs標(biāo)記可以反映黃牛3種單倍型組內(nèi)豐富的Y染色體單倍型與遺傳多樣性。將Y-SNPs與Y-STRs分子標(biāo)記結(jié)合使用可以完整地反映Y染色體單倍型結(jié)構(gòu)，這種方法目前已經(jīng)廣泛用于家牛的遺傳多樣性和父系起源研究[3]。Edwards等[7]利用Y-SNPs與Y-STRs方法研究了世界范圍的138個牛品種，分析了不同品種Y染色體單倍型的地理分布情況，發(fā)現(xiàn)歐洲牛只擁有普通牛單倍型組，而瘤牛單倍型組主要分布在亞洲西南部。Li等[8]對16個中國地方黃牛品種共302頭黃牛公牛的4個Y-SNPs標(biāo)記(DDX3Y-7、ZFY-9、ZFY-10和UTY-19)和2個Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)進(jìn)行了多態(tài)性分析，與常振華等[4]的結(jié)論一致，但是卻發(fā)現(xiàn)有些個體含有Y1單倍型組，推測在中國黃牛中低頻率的Y1單倍型組可能是由于外來牛品種的雄性滲入的原因[8]。趙曉誠等[9]利用Y-SNPs標(biāo)記分析陜西嶺南牛的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)嶺南牛屬于南方黃牛類型，有普通牛Y2和瘤牛Y3 兩個父系起源，尤以瘤牛起源為主。

本研究中，利用Y-SNPs與Y-STRs分子標(biāo)記相結(jié)合的方法對大別山牛的Y染色體多態(tài)性進(jìn)行研究，分析其遺傳多樣性及父系起源。利用Y-SNPs標(biāo)記確定大別山牛只有一個Y3單倍型組，利用Y-STRs標(biāo)記的等位基因大小確定了大別山牛Y3單倍型組中詳細(xì)的單倍型，結(jié)果顯示49頭大別山牛全部為Y3-88-156單倍型，單倍型頻率為1，說明大別山牛只有一個瘤牛父系起源。Jia等[10]利用mtDNA D-loop序列研究六個亞洲國家家牛的母系起源，其中對3頭大別山牛進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)3頭大別山牛均為瘤牛I1支系，結(jié)合本文研究結(jié)果，說明從父系和母系角度都支持大別山牛為瘤牛起源。

單倍型多樣度是衡量一個群體變異程度的重要指標(biāo)。Li等[8]對16個中國地方黃牛品種共302頭黃牛公牛的父系遺傳多樣度表明，各個品種的平均單倍型多樣度值為0.683±0.013；而本研究中大別山牛的單倍型頻率為1，單倍型多樣度為0，說明大別山牛的父系遺傳多樣性很低，父系遺傳單一，品種很純。由于大別山牛所處地理位置較為偏僻，與外界基因交流少，牛群多為封閉性選育和小群飼養(yǎng)，公牛有效群體較小等原因?qū)е缕溥z傳多樣性很低。因此，應(yīng)該樹立正確的品種資源保護(hù)意識，建立健全大別山牛保種體系，從而使這一優(yōu)良種質(zhì)資源得到有效保護(hù)和利用。

參考文獻(xiàn):

[1] 常振華, 黃潔萍, 徐蘋,等. 中國黃牛Y-STRs遺傳多樣性與起源研究[J]. 中國牛業(yè)科學(xué), 2012, 38(3): 9-13.

[2] 邱懷. 中國牛品種志[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1986.

[3] 李冉, 常振華, 徐蘋, 等. 黃牛Y染色體分子遺傳多樣性研究進(jìn)展[J].中國牛業(yè)科學(xué), 2012, 38(04): 43-47.

[4] 常振華, 衛(wèi)利選, 張潤鋒,等. 中國黃牛Y-SNPs遺傳多樣性與起源研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2011, 42(11):1537-1542.

[5] G?therstr?m A, Anderung C, Hellborg L, et al. Cattle domestication in the Near East was followed by hybridization with aurochs bulls in Europe[J]. Proceedings of the Royal Society B:Biological Sciences, 2005, 272: 2345-2351.

[6] Ginja C, Da Gama LT, Telo da Gama L, et al. Y chromosome haplotype analysis in Portuguese cattle breeds using SNPs and STRs[J]. Journal of Heredity, 2009, 100(2):148-157.

[7] Edwards CJ, Ginja C, Kantanen J, et al. Dual origins of dairy cattle farming-Evidence from acomprehensive survey of Europea Y-chromosomal variation [J]. PLoS One, 2011,6:el5922.

[8] Li R, Zhang XM, Campana MG, et al. Paternal origins of Chinese cattle[J].Animal Genetics, 2013, 44(4):446-449.

[9] 趙曉誠，林清，左自意，等. 嶺南黃牛Y-SNP遺傳多樣性與父系起源研究[J].中國牛業(yè)科學(xué)，2017, 43(4): 4-6.

[10] Jia S, Zhou Y, Lei C, et al. A new insight into cattle's maternal origin in six Asian countries[J].Journal of Genetics and Genomics, 2010,37(3):173-180.