淺談新型冠狀病毒疫苗的研發(fā)

朱飛 崔艷慧 潘頻華

中南大學(xué)湘雅醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，長沙410008

冠狀病毒是1937年從雞身上分離出來[1]。1965年，Tyrrell等[2]從普通感冒患者鼻洗液中分離出一株病毒，命名為B814病毒。Hamre等[3]用人胚腎細(xì)胞分離到類似病毒，代表株命名為229E病毒。1967年，Mclntosh等[4]用人胚氣管培養(yǎng)從感冒患者中分離到一批病毒，其代表株是OC43株。1975年，國際病毒命名和分類委員會正式命名了冠狀病毒科。冠狀病毒主要感染鳥類和哺乳動物，并僅限于其天然宿主，難以跨越物種屏障，在早期并未發(fā)現(xiàn)動物冠狀病毒感染人類的相關(guān)報道[5]。2002-2003年間SARS爆發(fā)流行，感染人數(shù)達(dá)8096例，全球有774例死亡病例[6]。2012-2019年，全球報告了2 494例實(shí)驗(yàn)室確診中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-Co V)感染病例，其中有858例死亡病例[7]。冠狀病毒的跨物種傳播帶給人類慘痛的教訓(xùn)。時至今日，新型冠狀肺炎(COVID-19)全球性的爆發(fā)流行再次給人類敲響警鐘。

1 冠狀病毒概述

冠狀病毒是一種單股正鏈RNA的包膜病毒，基因組長度為26～32 kb，是基因組最長的RNA病毒。冠狀病毒根據(jù)其遺傳物質(zhì)和抗原可分為四大類：α-冠狀病毒、β-冠狀病毒、γ-冠狀病毒以及δ-冠狀病毒[8]。目前在人與人之間傳播的冠狀病毒有HCo V-OC43、HCo V-229E、HCo VNL63、HCo V-HKU1、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARSCo V)、MERS-Co V及最近發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒，即嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-Co V-2)，其 中HCo V-229E、HCo V-NL63屬于α-冠狀病毒，而HCo V-OC43、HCo V-HKU1、SARS-Co V、MERS-Co V和SARS-Co V-2屬于β-冠狀病毒，后3種β-冠狀病毒傳染性極強(qiáng)，為人畜共患病毒[9]。冠狀病毒基因組編碼4個主要的結(jié)構(gòu)蛋白：刺突(S)蛋白、核衣殼(N)蛋白、膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白[10]。S蛋白介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，促使病毒進(jìn)入受體細(xì)胞[11]。N蛋白的主要功能是結(jié)合冠狀病毒RNA，組成核衣殼[12]。M蛋白是結(jié)構(gòu)最為豐富的蛋白，可以定義病毒包膜的形狀[13]，也被認(rèn)為是冠狀病毒的主要組裝者，與其它所有冠狀病毒蛋白相互作用[9]。E蛋白是主要結(jié)構(gòu)中最小的蛋白，復(fù)制周期中在感染者體內(nèi)的細(xì)胞大量表達(dá)，但只有一小部分參與病毒包膜的構(gòu)建[10]，大部分E蛋白定位在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸中心，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體[15]。

SARS-Co V-2在冠狀病毒的系統(tǒng)樹上與SARS-Co V密切相關(guān)[16]，SARS-Co V-2與SARS-Co V和BAT-Co V的基因組序列同源性分別為79.6%和96%[17]，國際病毒分類委員會將其命名為SARS-Co V-2。SARS-Co V-2是一種球形包膜病毒，直徑50～200 nm，其基因組長度為30 kb[18-19]，推測SARS-Co V-2有10～12個開放閱讀框(open reading frame，ORF)[20]。SARS-Co V-2基因組編碼的四種結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白對SARS-Co V-2的附著和進(jìn)入宿主細(xì)胞起重要作用[19]。在感染過程中，三聚體的S蛋白會被裂解成亞基S1和S2，S1亞基含有受體結(jié)構(gòu)域(receptor binding domain，RBD)負(fù)責(zé)和受體結(jié)合，S2則負(fù)責(zé)與膜融合[21]。SARS-Co V-2的S蛋白和SARS-Co V S的結(jié)合受體一樣，都是通過結(jié)合宿主細(xì)胞的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)受體[19]進(jìn)入宿主細(xì)胞。Wrapp等[18]通過3D結(jié)構(gòu)分析表明，與SARS-Co V相比，SARS-Co V-2與ACE2受體的親和力更高。

2 SARS-CoV-2疫苗的研發(fā)策略

S蛋白、N蛋白、M蛋白和E蛋白是冠狀病毒的包膜蛋白，位于病毒表面，理論上都能產(chǎn)生中和抗體保護(hù)機(jī)體。在SARS-Co V或MERS-Co V基因組編碼的蛋白中，S蛋白是主要的病毒抗原成分，可誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，從而阻斷病毒結(jié)合，刺激宿主免疫反應(yīng)，故以S蛋白作為疫苗開發(fā)的主要目標(biāo)。對于SARS-Co V-2，用單克隆抗體進(jìn)行的研究表明，感染SARS-Co V-2的患者對S蛋白，特別是S蛋白RBD，產(chǎn)生了強(qiáng)大的中和抗體反應(yīng)[22-23]。在SARS-Co V疫苗的研究中，已經(jīng)針對S蛋白開發(fā)出了亞單位疫苗、重組載體疫苗和DNA疫苗等。借鑒早期SARS-Co V和MERSCo V疫苗的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，Tostanoski等[24]利用26型腺病毒作為載體導(dǎo)入SARS-Co V-2S蛋白相關(guān)基因，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)S蛋白的26型腺病毒載體疫苗，在倉鼠動物模型中該疫苗單次免疫可誘導(dǎo)結(jié)合和中和抗體反應(yīng)，并對SARS-Co V-2導(dǎo)致的體質(zhì)量減輕和肺炎具有保護(hù)作用，降低病死率。陳薇教授團(tuán)隊同樣以腺病毒為載體，開發(fā)出表達(dá)SARS-Co V-2S蛋白的復(fù)制缺陷Ad5載體疫苗，并表明黏膜接種Ad5-nCo V可以完全保護(hù)小鼠的上呼吸道和下呼吸道免受SARS-Co V-2感染[25]。單次肌肉接種Ad5-nCo V可保護(hù)小鼠肺部免受SARS-Co V-2感染，并顯著減少病毒在小鼠和雪貂上呼吸道的復(fù)制。目前，Ad26疫苗和Ad5-ncov疫苗均已進(jìn)入Ⅲ臨床試驗(yàn)。

除了S蛋白，對SARS-Co V的早期研究表明，大多數(shù)感染者對N蛋白產(chǎn)生了抗體應(yīng)答[26]。然而，接種表達(dá)N蛋白的疫苗不會對SARS-Co V攻擊產(chǎn)生保護(hù)作用，還會增加感染，其特征是肺內(nèi)嗜酸粒細(xì)胞浸潤增加[27]。同樣，接種了表達(dá)N蛋白的重組痘苗病毒的BALB/c小鼠在隨后的SARS-Co V感染時觀察到病毒感染增強(qiáng)[28]。以上研究均表明N蛋白不適合作為疫苗靶標(biāo)。

盡管已證明SARS-Co V患者血清對M蛋白有反應(yīng)，由于免疫原性較低，M蛋白作為疫苗靶標(biāo)的可能性較低[29]。有研究表明可以將E蛋白為靶標(biāo)開發(fā)疫苗[16，30]。E蛋白參與MERS-Co V的毒力構(gòu)建，敲除E蛋白的編碼基因可導(dǎo)致病毒毒力減弱。Almazan等[16]研究表明缺失E蛋白的MERS-Co V仍具有復(fù)制能力，但傳播能力有缺陷。在敲除E蛋白基因的SARS-Co V中也觀察到類似現(xiàn)象[32]。這為SARS-Co V-2疫苗的開發(fā)提供了另一種思路，可以通過對E蛋白的基因進(jìn)行編輯獲得減毒病毒，但對于其用于減毒疫苗的制備及其安全性還有待進(jìn)一步研究。

除了以結(jié)構(gòu)蛋白為靶標(biāo)開發(fā)疫苗外，還可開發(fā)多表位疫苗。多表位疫苗是一種同時攜帶多個抗原表位的疫苗，這類疫苗可以和不同型別的MHC分子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)高效提呈，并可誘導(dǎo)很強(qiáng)的細(xì)胞免疫。有研究發(fā)現(xiàn)處于恢復(fù)期的SARS-Co V感染者的抗體應(yīng)答是短暫的[31]，而T細(xì)胞免疫可以提供長期保護(hù)[32-33]，所以研制出多表位疫苗對于SARS-Co V-2防治也有著重要作用。Baruah和Bose[34]通過生物信息分析在SARS-Co V-2表面糖蛋白鑒定出5個CTL表位、3個連續(xù)的B細(xì)胞表位以及5個不連續(xù)的B細(xì)胞表位，發(fā)現(xiàn)除了CTL表位-VVNQNAQAL與SARS-Co V的相同外，與BAT-Co V，SARS-Co V和MERS-Co V相比，所有鑒定出的連續(xù)CTL和B細(xì)胞表位對于SARS-Co V-2是唯一的，而CTL表位-EPVLKGVKL與其他冠狀病毒的相應(yīng)序列都不匹配。Ahmed等[35]則分析那些已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)室確定的SARS-Co V的B細(xì)胞和T細(xì)胞表位，發(fā)現(xiàn)只有23%的T細(xì)胞表位和16%的B細(xì)胞表位可在SARS-Co V-2中找到，并且沒有突變。在這些表位因病毒基因組突變被取代前，制備出SARS-Co V-2相關(guān)疫苗才能有效遏制SARSCo V-2的傳播。

借鑒早期SARS-Co V和MERS-Co V的開發(fā)經(jīng)驗(yàn)，SARS-Co V-2疫苗的研發(fā)進(jìn)展迅速。截至2020年12月10日，WHO公布全球共有52種SARS-Co V-2候選疫苗進(jìn)行臨床評估，其中有13種候選疫苗進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，162種SARS-Co V-2候選疫苗尚在臨床前試驗(yàn)[36]。

3 疫苗研究中所面臨的問題

3.1 冠狀病毒的變異 冠狀病毒為RNA病毒，由于RNA聚合酶沒有校正機(jī)制，導(dǎo)致很高的錯誤突變率，這種突變可能加速病毒變異。有研究發(fā)現(xiàn)，在2002-2003年SARSCo V的流行期間，SARS-Co V發(fā)生突變以便于更好結(jié)合到宿主細(xì)胞受體并在宿主細(xì)胞中復(fù)制，從而增強(qiáng)毒力。而MERS-Co V自發(fā)現(xiàn)以來并未發(fā)生實(shí)質(zhì)性突變，可能是因?yàn)镸ERS-Co V結(jié)合的功能性受體CD26是獨(dú)特的，所以病毒在健康宿主中發(fā)生突變的潛力有限[37]。Rahman等[38]以SARS-Co V-2武漢-HU-1株的全基因組序列為參考，通過非同義突變分析從全球共享所有流感數(shù)據(jù)庫(GISAID)中經(jīng)處理得到35750個全長S蛋白基因序列，發(fā)現(xiàn)27

801株(77.77%)SARS-Co V-2變異株。同時，該團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)SARS-Co V-2S蛋白共有988個獨(dú)特的氨基酸替換，分布在660個位點(diǎn)，其中有11個高度可變的位點(diǎn)：32、142、146、215、261、477、529、570、622、778、791、1146、1162。在第614位出現(xiàn)了2個變異體即D614和G614，而在74.82%(n=26749)的序列中發(fā)現(xiàn)了D614G。D614G突變出現(xiàn)于COVID-19流行的早期，Zhang等[39]的研究表明D614G的突變增加了SARS-Co V-2S蛋白的密度及傳染性。該突變的頻率迅速增加已成為全球病毒的主導(dǎo)形式[38，40]。Weissman等[41]的研究表明接種了SARS-Co V-2疫苗的小鼠、非靈長類動物和D614變異SARS-Co V-2的免疫原的人類可產(chǎn)生中和抗體來中和帶有G614突變與D614突變的SARS-Co V-2S蛋白，這表明G614突變或D614突變的SARS-Co V-2并不能逃脫中和。Weissman團(tuán)隊的研究結(jié)果緩解了對于SARS-Co V-2突變的擔(dān)憂，但依舊警惕未來病毒的變異導(dǎo)致相關(guān)疫苗的作用減弱等。

3.2 動物模型的選擇 由于SARS-Co V-2的S蛋白和SARS-Co V的S蛋白都可以通過結(jié)合宿主細(xì)胞ACE2受體介導(dǎo)病毒感染，理論上用于研究SARS-Co V免疫應(yīng)答機(jī)制的動物模型也可用于SARS-Co V-2疫苗的研究。早期用于研究SARS-Co V的動物模型已經(jīng)有恒河猴、小鼠、貓、敘利亞金色倉鼠和雪貂等，而用于SARS-Co V疫苗評價的包括小鼠和恒河猴[42]。曾經(jīng)被用于SARS-Co V感染研究的小鼠模型包括BALB/c、C57BL6(B6)和129Sv Ev譜系小鼠[43-45]。但Zhou等[46]的研究表明SARS-Co V-2可與人、中國馬蹄蝙蝠、麝貓或豬的ACE2受體結(jié)合，但不能和小鼠的ACE2受體結(jié)合。Shang等[47]的研究表明ACE2受體上和S蛋白RBD結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)為第31位和第353位的賴氨酸殘基位點(diǎn)。而小鼠ACE2受體的第82位點(diǎn)和第353位點(diǎn)的殘基與人類的ACE2受體的不一樣，導(dǎo)致了SARSCo V-2的S蛋白不能結(jié)合小鼠的ACE2受體[48]。目前，有2種方法可使小鼠感染SARS-Co V-2。第一種是通過SARSCo V-2在BALB/c小鼠的肺部連續(xù)傳代，直到病毒S蛋白RBD適應(yīng)于小鼠ACE2受體[49]。Wang等[50]采用該種方法得到了小鼠適應(yīng)性病毒HRB26 M，該病毒能有效感染BALB/c小鼠和C57小鼠的上呼吸道和下呼吸道，并導(dǎo)致肺部病變。第二，利用基因工程技術(shù)建立表達(dá)人ACE2受體的小鼠模型或?qū)蛋白RBD進(jìn)行改造，使小鼠感染SARS-Co V-2[51]。早在MERS-Co V相關(guān)研究中，小鼠不表達(dá)人類二基肽酶4受體[52]。Zhao等[53]則利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立表達(dá)人類二基肽酶4受體的小鼠模型，該模型在感染MERS-Co V后表現(xiàn)出急性呼吸道損傷及肺外器官損傷。Sun等[54]最近利用CRISPR/Cas9技術(shù)開發(fā)了一種表達(dá)人ACE2受體的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，將人ACE2受體cDNA敲入小鼠ACE2位點(diǎn)。這個模型對SARS-Co V-2感染高度敏感。然而，小鼠在感染SARS-Co V-2后的體質(zhì)量減輕和肺部病變比較輕微。

除小鼠外，敘利亞倉鼠也被認(rèn)為是對SARS-Co V-2高度易感的臨床前模型。Rosenke等[55]的研究表明敘利亞倉鼠對SARS-Co V-2高度易感，并可導(dǎo)致中到重度支氣管間質(zhì)性肺炎。另外兩項(xiàng)研究表明在實(shí)驗(yàn)性鼻腔感染后，敘利亞倉鼠可表現(xiàn)出輕到中度的臨床癥狀，并在感染后很早(接種后1～2d)就出現(xiàn)進(jìn)行性體質(zhì)量下降。所有受到不同SARS-Co V-2分離株感染的倉鼠都一直顯示出呼吸窘迫的跡象，包括呼吸困難[56-57]。

早期研究表明，恒河猴、非洲綠猴和食蟹獼猴可感染SARS-Co V，并可在這些不同種非人類靈長動物中發(fā)現(xiàn)病毒感染后的肺炎征象[58-60]。Lu等[61]的研究表明恒河猴、食蟹獼猴和普通恒河猴可感染SARS-Co V-2，且在肺部均觀察到了肺損傷和其他組織病理學(xué)異常，而恒河猴和食蟹獼猴的肺損傷更為明顯。同樣，最近有研究證明非洲綠猴是適用于SARS-Co V-2的非人類靈長類動物模型[62]。然而，面對眾多的候選藥物和疫苗，非靈長類動物的供應(yīng)有限，這使得它們成為一種更加寶貴的資源。因此，可通過較小的哺乳動物模型優(yōu)先測試藥物，以證明其耐受性和有效性。小鼠、敘利亞倉鼠是目前比較合適的用于評估疫苗效果的小動物物種。但與小鼠相比，用于疫苗評價及研究的敘利亞倉鼠模型依舊較少。然而，不同小鼠模型感染SARS-Co V-2所表現(xiàn)出的臨床癥狀并不能完全反映人類感染SARS-Co V-2出現(xiàn)的臨床癥狀，所以對于疫苗的臨床前實(shí)驗(yàn)研究，則需要多種動物模型聯(lián)合評估疫苗的效果。

3.3 抗體依賴性增強(qiáng)作用(antibody-dependent enhancement，ADE) ADE是病毒的疫苗設(shè)計及抗體類藥物制備考慮的主要問題之一。ADE早期受關(guān)注是因?yàn)镾ARS患者的血清轉(zhuǎn)化及中和抗體反應(yīng)與患者臨床癥狀嚴(yán)重程度及病死率密切相關(guān)[63]。而COVID-19患者中也有類似發(fā)現(xiàn)，更高的抗SARS-Co V-2抗體滴度與更嚴(yán)重的疾病密切相關(guān)[64]。ADE在病毒感染中主要通過2種機(jī)制發(fā)生。(1)通過抗體Fc段與靶細(xì)胞Fc受體結(jié)合，促進(jìn)表達(dá)Fcγ受體ⅡA的免疫細(xì)胞對病毒的攝取，使病毒進(jìn)入免疫細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和擴(kuò)散，導(dǎo)致感染增強(qiáng)。(2)病毒與抗體結(jié)合激活補(bǔ)體途徑，形成病毒-抗體-補(bǔ)體復(fù)合物。該復(fù)合物與細(xì)胞表面補(bǔ)體受體結(jié)合，促進(jìn)病毒內(nèi)化與感染增強(qiáng)。當(dāng)?shù)偷味鹊姆侵泻涂贵w或亞中和抗體不再發(fā)揮中和作用時，這兩種ADE的途徑都有可能發(fā)生[65]。在SARS-Co V疫苗的開發(fā)過程中，Kam等[66]發(fā)現(xiàn)了包含全長S蛋白的VLP疫苗存在抗體依賴性感染增強(qiáng)的現(xiàn)象。Wan等[67]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明MERS-Co VRBD的特異性中和單克隆抗體MAb(Mersmab1)可模仿病毒受體介導(dǎo)MERS-Co V的ADE現(xiàn)象產(chǎn)生。Luo等[68]用SARS-Co V滅活病毒疫苗建立了低中和抗體水平的恒河猴模型，并用SARS-Co V感染該模型，卻并未見到病毒復(fù)制增強(qiáng)。另一項(xiàng)研究中，Wang等[69]用SARS-Co VS蛋白的4個B細(xì)胞多肽表位免疫獼猴后，發(fā)現(xiàn)其中3種多肽可誘導(dǎo)抗體保護(hù)獼猴免受病毒攻擊，另一種多肽則明顯增強(qiáng)細(xì)胞及獼猴SARS-Co V的感染，并導(dǎo)致獼猴出現(xiàn)更嚴(yán)重的肺損傷。因此，關(guān)于ADE相關(guān)的研究結(jié)果有很大的差異，這可能與疫苗的策略有關(guān)。理論上誘發(fā)病理性ADE的疫苗如滅活病毒疫苗，可能含有非中和抗原靶點(diǎn)和/或非中和構(gòu)象的S蛋白，為抗體提供了大量非保護(hù)性靶點(diǎn)，這些抗體可能通過對其他呼吸道病原體觀察到的機(jī)制引發(fā)額外的炎癥。因此，以S蛋白中和抗原靶點(diǎn)的表位設(shè)計為表位疫苗以減少非中和抗體的產(chǎn)生，可能是解決這一問題的潛在方向之一。另一種降低ADE發(fā)生風(fēng)險的潛在方向?yàn)樘岣咧泻涂贵w的效價。Liu等[70]發(fā)現(xiàn)Fc融合蛋白可顯著增強(qiáng)SARS-Co V-2RBD免疫原誘導(dǎo)的中和抗體滴度，佐劑MF59可進(jìn)一步增強(qiáng)RBD-Fc融合蛋白的抗原性，降低ADE的發(fā)生風(fēng)險。

4 總結(jié)

全球COVID-19疫情仍在繼續(xù)，快速開發(fā)SARS-Co V-2疫苗已成為當(dāng)務(wù)之急。目前，全球已經(jīng)有200多種疫苗處于研發(fā)中，有13種候選疫苗進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，這讓我們看到了結(jié)束疫情的希望。目前，尚有162種SARS-Co V-2候選疫苗處于臨床前試驗(yàn)，仍然需要考慮SARS-Co V-2疫苗研制中所存在的問題，如ADE現(xiàn)象、病毒的突變、動物模型的選擇等。除此之外，表位疫苗的表位選擇、疫苗佐劑的選擇、疫苗的效果評價等問題也不能忽視，期待不久后研發(fā)出更加安全有效的疫苗以應(yīng)對COVID-19疫情。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突