microRNA在原發(fā)性膽汁性膽管炎發(fā)病機(jī)制及診斷治療中的作用

裴昱豐 王萍 賈繼東

微小核糖核酸(microRNA, miRNA)是一類長度為19～24個核苷酸的非編碼小RNA分子，可以通過堿基互補(bǔ)配對原則與靶基因mRNA的3’端非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3′ untranslated region, 3′UTR)相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)目標(biāo)mRNA的降解或阻止其翻譯從而下調(diào)該基因的表達(dá)。作為重要的表觀遺傳學(xué)分子，miRNA可參與細(xì)胞命運(yùn)決定、免疫功能調(diào)節(jié)、組織發(fā)育調(diào)控等多種生物學(xué)過程。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2 500余種miRNA分子，而一個miRNA可以調(diào)節(jié)上百個編碼基因的表達(dá)，因此miRNA和基因表達(dá)的關(guān)系非常復(fù)雜。

原發(fā)性硬化性膽管炎(Primary biliary cholangitis, PBC)是一種自身免疫介導(dǎo)的、中年女性多發(fā)的肝內(nèi)膽汁淤積性疾病。本病臨床上以血清中堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)升高和抗線粒體抗體尤其是M2亞型(Anti-mitochondrial antibody subtype M2，AMA-M2)陽性為主要特點(diǎn)，病理上以肝內(nèi)小膽管細(xì)胞非化膿性變性、壞死及匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤為主要特征。PBC患者肝組織[1]、外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMC)[2]、血清[3]中miRNA的表達(dá)譜均有顯著變化，這些差異表達(dá)的miRNA可參與激活免疫反應(yīng)、促進(jìn)膽管細(xì)胞凋亡等過程，從而導(dǎo)致PBC疾病的發(fā)生與進(jìn)展。本文將綜述miRNA調(diào)控PBC發(fā)生、進(jìn)展的細(xì)胞分子機(jī)制和miRNA用作PBC疾病的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的研究進(jìn)展。

一、miRNA調(diào)控PBC疾病發(fā)生、進(jìn)展的細(xì)胞分子機(jī)制

(一)miRNA參與PBC中免疫細(xì)胞的活化過程 PBC的發(fā)生、進(jìn)展過程涉及多種免疫細(xì)胞的功能失調(diào)，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)功能下降、具有促炎作用的輔助性(T helper, Th)17細(xì)胞增多、匯管區(qū)CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤、B細(xì)胞產(chǎn)生針對抗線粒體E2亞基(Pyruvate dehydrogenase complex E2, PDC-E2)的自身抗體等。利用基因芯片對PBC患者與健康對照PBMC、CD4+T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，很多差異表達(dá)的miRNA在PBC免疫細(xì)胞活化方面發(fā)揮了重要作用。

1. PBMC中miR-155表達(dá)增加與Treg細(xì)胞的免疫抑制功能下降有關(guān)

與健康對照相比，PBC患者PBMC中具有免疫抑制功能的Treg細(xì)胞數(shù)量與比例均顯著下降，Treg細(xì)胞分泌的、具有抑炎作用的白細(xì)胞介素(Interleukin, IL)-10也明顯減少，導(dǎo)致T細(xì)胞數(shù)量增加、抗原遞呈細(xì)胞(包括樹突細(xì)胞和B細(xì)胞)中共刺激分子CD86表達(dá)顯著增加，進(jìn)而促進(jìn)了PBC的疾病進(jìn)展[4]。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressor of cytokine signaling, SOCS)-1可增強(qiáng)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能[5]，而PBC患者肝組織中，SOCS-1表達(dá)水平與Treg細(xì)胞標(biāo)志物FoxP3表達(dá)水平的比值較健康對照顯著下降，同時miR-155水平顯著升高，提示miR-155表達(dá)增加可能參與了降低Treg細(xì)胞的免疫抑制功能，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重[6]。

2. PBMC中miRNA-92a表達(dá)下降增加了促炎Th17細(xì)胞數(shù)量

IL-17是主要表達(dá)于Th17細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子。與健康對照相比，PBC患者血清中、PBMC中及肝臟匯管區(qū)IL-17水平均顯著升高，而且PBMC中IL-17的表達(dá)水平與PBC嚴(yán)重程度正相關(guān)[7]，提示Th17細(xì)胞數(shù)量增加或功能增強(qiáng)可能與PBC疾病密切相關(guān)。PBC患者血清miR-92a的水平較健康對照顯著降低，且miR-92a水平與Th17細(xì)胞數(shù)量增加之間呈負(fù)相關(guān)，表明miR-92a表達(dá)降低與PBC患者中促炎Th17細(xì)胞數(shù)量增加有關(guān)[3]。

3. CD4+T細(xì)胞中miR-425、miR-181a表達(dá)下降加重了PBC的炎癥反應(yīng)

PBC患者膽管細(xì)胞表達(dá)的PDC-E2遞呈給CD4+T細(xì)胞后，PBC患者的外周血、肝臟、肝臟引流淋巴結(jié)中，針對PDC-E2的自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞數(shù)量較健康對照顯著增加，同時Th1細(xì)胞表達(dá)的干擾素(Interferon, IFN-γ)水平亦顯著升高。在PBC患者CD4+T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了5個較健康對照者表達(dá)顯著下調(diào)的miRNA (miR-181a、181b、361-5p、374b和425)[8]。其中，miR-425可以結(jié)合到N-Ras mRNA的3’-UTR區(qū)并抑制其表達(dá)，而N-Ras具有促進(jìn)炎癥因子IL-2與IFN-γ表達(dá)[8]和促進(jìn)CD4+T細(xì)胞活化的作用[9]。PBC患者CD4+T細(xì)胞中N-Ras表達(dá)顯著增加[9]，可能是由于miR-425表達(dá)下降導(dǎo)致了N-Ras水平升高，加重了CD4+ T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。另外，miRNA-181a也是被驗(yàn)證過在PBC患者CD4+T細(xì)胞中較健康對照、慢性乙型肝炎患者表達(dá)顯著下降的miRNA，其表達(dá)水平與靶基因BCL-2表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示CD4+T細(xì)胞中miR-181a表達(dá)降低使得BCL-2表達(dá)增加，由于BCL-2具有抑制淋巴細(xì)胞凋亡的作用，提示miR-181a可能與PBC中CD4+T細(xì)胞相關(guān)炎癥反應(yīng)加重有關(guān)[10]。

醫(yī)院信息中心確保時時維護(hù)和管理醫(yī)院醫(yī)保系統(tǒng)，保證醫(yī)保電腦專機(jī)專用并有備機(jī)，由信息中心專職技術(shù)人員專人負(fù)責(zé)，及時排查系統(tǒng)故障，保障醫(yī)院系統(tǒng)的正常運(yùn)行。如遇社保局網(wǎng)絡(luò)故障，盡快與其溝通，并做好患者及家屬的安撫工作，網(wǎng)絡(luò)恢復(fù)后及時辦理相關(guān)業(yè)務(wù)。

4. B淋巴細(xì)胞中miR-223-3p、miR-21-5p表達(dá)下降與自身抗體分泌增加有關(guān)

在PBC患者，持續(xù)的B細(xì)胞活化導(dǎo)致了血清PDC-E2抗體、抗核抗體(gp210、sp100)水平顯著升高[11]。與健康對照相比，PBC患者外周血B淋巴細(xì)胞中有558個差異表達(dá)的miRNA，其中miR-223-3p和miR-21-5p的表達(dá)從I期到III期PBC患者持續(xù)顯著下降。這些miRNA所針對的靶基因涉及細(xì)胞遷移、分化、凋亡和信號傳遞等生物學(xué)過程，可能與PBC疾病進(jìn)展過程中B細(xì)胞成熟分化、分泌針對PDC-E2抗體有關(guān)[12]。

(二) miRNA參與膽管細(xì)胞功能障礙和肝細(xì)胞損傷的過程 PBC以表達(dá)PDC-E2的膽管細(xì)胞受到免疫細(xì)胞特異性攻擊為特征。盡管研究發(fā)現(xiàn)遺傳因素、環(huán)境因素都可能參與了PBC的誘發(fā)過程，但是具體誘因目前仍未確定。一些證據(jù)顯示，miR-26a、miR-506表達(dá)增加導(dǎo)致膽管細(xì)胞功能障礙；而miR-210與miR-21參與了PBC所致肝臟膽汁淤積對肝細(xì)胞的損傷過程。

1. 膽管細(xì)胞中miR-506表達(dá)增加導(dǎo)致其功能障礙

利用miRNA芯片技術(shù)比較PBC肝移植患者的病肝組織與非肝病對照者的肝組織，發(fā)現(xiàn)了35種差異表達(dá)的miRNA[1]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，其中的miR-26a與miR-506參與了PBC的疾病發(fā)生過程。

PBC患者肝組織中高表達(dá)的miR-26a，可以特異性地靶向多梳家族蛋白——Zeste2多克隆抑制復(fù)合物2亞單位增強(qiáng)子 (enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2)，導(dǎo)致EZH2蛋白表達(dá)水平降低[13]。由于EZH2能通過募集Bmi1促進(jìn)膽管細(xì)胞增殖、抑制其衰老[14]，因此miR-26a可能通過降低EZH2的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制膽管細(xì)胞增殖、促進(jìn)其衰老的作用。

miR-506特異性地表達(dá)于膽管上皮細(xì)胞，在PBC患者肝組織中其表達(dá)水平顯著增加[15]。促炎細(xì)胞因子IL-8、IL-12、IL-17、IL-18及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α具有上調(diào)miR-506表達(dá)的作用[16]。過表達(dá)miR-506可以增加膽管上皮細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平、PDC-E2表達(dá)水平及DNA損傷標(biāo)志物的表達(dá)水平，而且增加的PDC-E2不僅位于細(xì)胞質(zhì)中，也位于細(xì)胞膜上，這導(dǎo)致膽管細(xì)胞成為免疫細(xì)胞攻擊的靶點(diǎn)[16]。

正常情況下，膽管細(xì)胞通過分泌HCO3-使膽汁呈弱堿性，并形成碳酸氫鹽保護(hù)傘，從而避免膽汁酸直接作用于膽管細(xì)胞。當(dāng)膽管細(xì)胞miR-506表達(dá)增加時，miR-506可以結(jié)合到Cl-/HCO3-陰離子交換蛋白2(anion exchanger 2，AE2)mRNA的5’-UTR區(qū)，進(jìn)而降低膽管細(xì)胞的AE2表達(dá)水平與活性[15]。由于AE2是分泌素刺激膽管細(xì)胞分泌碳酸氫鹽、維持膽汁pH穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵分子，缺少AE2使得膽管細(xì)胞對疏水性膽汁酸鵝脫氧膽酸或甘氨鵝去氧膽酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加敏感[16]。miR-506還可結(jié)合于膽管細(xì)胞特異性表達(dá)的三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, InsP3R)mRNA的3’-UTR區(qū)域，降低其蛋白表達(dá)水平[17]。由于InsP3R3能通過Ca2+信號來調(diào)控膽管細(xì)胞向膽汁中分泌碳酸氫鹽[18-19]，故缺少InsP3R可以抑制膽管細(xì)胞碳酸氫鹽的分泌過程，導(dǎo)致膽管細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)且細(xì)胞凋亡增加[20]。有研究結(jié)果顯示，向膽管上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-506的反義序列可以降低miR-506水平，從而降低PDC-E2表達(dá)、促進(jìn)膽管細(xì)胞碳酸氫鹽分泌、減輕膽管細(xì)胞損傷，是非常有前景的PBC治療靶點(diǎn)[15]。

2. 肝細(xì)胞中miR-210與miR-21表達(dá)增加加重了膽汁淤積對肝細(xì)胞的損傷

在PBC的病理發(fā)生過程中，膽管細(xì)胞損傷所導(dǎo)致的膽汁淤積狀態(tài)也會對肝細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。有研究發(fā)現(xiàn)，膽汁淤積性肝損傷小鼠模型和PBC患者肝組織中miR-210與miR-21的表達(dá)水平較正常對照均顯著增加。miR-210能抑制肝細(xì)胞中法尼醇X受體(farnesoid X receptor, FXR)的共刺激分子——混合性白血病甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase in mixed-lineage leukemia, MLL)4基因表達(dá)，從而阻斷MLL4促進(jìn)小異二聚體伴侶分子(small heterodimer Partner, Shp)和膽鹽輸出泵(bile salt export pump, Bsep)基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致肝臟膽汁酸代謝障礙與膽汁淤積[21]。miR-21可通過細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2相關(guān)蛋白1 (cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1, CDK2AP1)促進(jìn)肝細(xì)胞壞死；去除miR-21能夠減輕肝細(xì)胞壞死、改善對膽汁酸的適應(yīng)性應(yīng)答、并能夠改善氧化應(yīng)激與肝纖維化[22]，提示miR-21有可能作為膽汁淤積性肝病的治療靶點(diǎn)。

二、miRNA有助于PBC的鑒別診斷、疾病分期評估和療效評價

miRNA在血清中穩(wěn)定存在，不易被RNA酶降解，所以血清和PBMC中差異表達(dá)的miRNA都可能作為輔助PBC診斷和評價療效的生物標(biāo)志物。

(一)miRNA可作為PBC診斷的輔助標(biāo)志物 PBC發(fā)病隱匿，目前臨床多根據(jù)血清ALP水平、AMA-M2滴度及肝臟組織病理學(xué)進(jìn)行診斷。但是，也有AMA-M2陰性的PBC患者，且早期病例ALP水平并不一定升高。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-let-7b在PBC患者PBMC中表達(dá)水平較健康對照者顯著降低，而且與疾病分期、Mayo風(fēng)險評分、血清 IL-18水平及血清ALP水平呈負(fù)相關(guān)[23]，有可能作為PBC早期診斷的輔助標(biāo)志物。

有研究發(fā)現(xiàn)，將三種miRNA組合(miR-122-5p、miR-141-3p和miR-26b-5p)診斷PBC的受試者工作特征曲線下面積(area under a receiver operating characteristic curve, AUC)為0.905(95%置信區(qū)間：0.857～0.953，敏感性80.5%，特異性88.3%)，其敏感性和特異性高于ALP(AUC=0.537，95%置信區(qū)間：0.195～0.434,P<0.001)和ANA(AUC=0.739, 95%置信區(qū)間：0.012～0.213,P=0.028 2)，但低于AMA(AUC=0.982，95%置信區(qū)間：0.0618～0.198,P=0.0002)；值得注意的是，這種miRNA組合診斷PBC臨床前階段、無癥狀階段、有癥狀階段及肝功能不全期的AUC分別為0.835、0.879、0.867及0.901[24]，提示該miRNA組合亦可能作為PBC早期診斷的血清標(biāo)志物。

miR-150可能通過靶向B前體細(xì)胞c-Myb mRNA降低轉(zhuǎn)錄因子c-Myb的表達(dá)水平，進(jìn)而阻斷B細(xì)胞發(fā)育并降低B細(xì)胞抗體合成[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，AMA陰性PBC患者血清miR-150水平顯著高于AMA陽性PBC患者及健康對照組，并與AMA抗體滴度負(fù)相關(guān)[26]，提示miR-150可以作為輔助診斷AMA陰性PBC的血清標(biāo)志物。

(二) miRNA有助于PBC與其他慢性肝病的鑒別診斷 PBC與其他慢性肝病的鑒別診斷也是困擾臨床醫(yī)生的問題。血清miRNA深度測序與實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，PBC患者血清miR-505-3p和miR-197-3p水平顯著低于慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎[27]。另有研究顯示，PBMC中 miR-26a、miR-299-5p、miR-328及miR-let-7a水平，可以鑒別PBC與AIH[28]。

(三)miRNA有助于評價PBC患者的治療應(yīng)答情況 目前，熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)是PBC治療首選的藥物。盡管UDCA對多數(shù)患者的膽汁淤積狀況均有一定程度改善，但生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示仍有30%～40%患者應(yīng)答不佳。血清miRNA芯片分析結(jié)果顯示，miR-125b、let-7b和miR-520a-5p有助于識別出UDCA應(yīng)答不佳的PBC患者[29]。而PBMC中miRNA檢測結(jié)果顯示，UDCA應(yīng)答不佳者miR-299-5p表達(dá)顯著高于正常對照者，并與ALP、GGT、總膽紅素、IgM水平呈正相關(guān)，而且中重度膽管炎PBC患者(2-3級)比輕度膽管炎PBC患者(0-1級)的miR-299-5p表達(dá)水平更高[28]，提示PBMC中的miR-299-5p有可能作為評價UDCA應(yīng)答不佳患者的指標(biāo)。

三、總結(jié)與展望

總之，多種miRNA分子參與了PBC疾病發(fā)生、進(jìn)展中免疫細(xì)胞的活化過程與肝臟細(xì)胞的損傷過程。針對肝臟細(xì)胞損傷過程，miR-506的反義序列具有減輕膽管細(xì)胞損傷的作用，miR-21可以改善肝細(xì)胞對膽汁酸的適應(yīng)性應(yīng)答，都是非常有前景的PBC治療靶點(diǎn)。針對免疫細(xì)胞活化過程，盡管發(fā)現(xiàn)了很多相關(guān)的miRNA，但目前相關(guān)機(jī)制研究尚不充分，仍未發(fā)現(xiàn)可用于治療PBC的miRNA靶分子。

基于PBC患者血清和PBMC中miRNA，目前發(fā)現(xiàn)了一些在PBC疾病鑒別診斷、分期評估和療效評價方面有價值的miRNA或miRNA組合，是對目前臨床上通過血清ALP水平、AMA-M2滴度及肝臟組織病理學(xué)對PBC疾病進(jìn)行評估的重要補(bǔ)充，期待經(jīng)過大規(guī)模的臨床前驗(yàn)證后，能夠有相關(guān)的診斷試劑盒應(yīng)用于臨床，以提高PBC患者診斷的準(zhǔn)確性，幫助醫(yī)生盡早發(fā)現(xiàn)UDCA應(yīng)答不佳患者并優(yōu)化治療策略。