肺炎支原體CARDS毒素致病機(jī)制和應(yīng)用研究進(jìn)展

方云 柏長(zhǎng)青 牛文凱 苑鑫

解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,北京100071

肺炎支原體 (Mycoplasma pneumoniae,MP)是中國(guó)社區(qū)獲得性肺炎的首位致病菌[1],也是引起軍隊(duì)、學(xué)校等聚集性群體暴發(fā)性感染常見(jiàn)的病原菌。MP 的致病機(jī)制目前研究仍不十分詳盡,主要有黏附損傷、膜融合損傷、營(yíng)養(yǎng)消耗、侵入性損傷、毒性損傷、炎性及免疫損傷等[2]。社區(qū)獲得性呼吸窘迫綜合征 (community acquired respiratory distress syndrome,CARDS)毒素是目前發(fā)現(xiàn)的MP唯一毒力因子,在MP的致病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)就CARDS毒素作一簡(jiǎn)要綜述,以期深入理解臨床MP感染。

1 CARDS毒素的發(fā)現(xiàn)

2005年Kannan等[3]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)用胰蛋白酶處理MP之后,MP與宿主細(xì)胞的結(jié)合力降低了80%～90%。由此發(fā)現(xiàn)了MP中有一種能與人表面結(jié)合蛋白結(jié)合的蛋白MPN372,它有591個(gè)氨基酸,相對(duì)分子質(zhì)量為68 000,后被命名為CARDS毒素[3-4]。

2 CARDS毒素的致病機(jī)制

2.1 分子結(jié)構(gòu)特征 CARDS毒素是由17 個(gè)α螺旋和43個(gè)β鏈折疊成等腰三角形的結(jié)構(gòu),N 端的單ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域 (D1)和C端串聯(lián)β-三葉結(jié)構(gòu)域 (D2+D3)結(jié)合以形成不同于其他公認(rèn)的ADP-核糖基化細(xì)菌毒素的整體結(jié)構(gòu)[5]。N 末端與百日咳毒素 (博德特菌外毒素)的S1亞基有27%的相似性[4]。C 末端的D3 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了CARDS毒素與宿主細(xì)胞的結(jié)合過(guò)程[5-6]。N 末端截短會(huì)影響到C端的功能,推測(cè)N 末端在維持C端的構(gòu)象上發(fā)揮重要作用[6]。Balasubramanian等[7]研究證實(shí)CARDS毒素形成了分子內(nèi)二硫鍵,二硫鍵可以保護(hù)CARDS毒素的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶免受蛋白酶的破壞,而且缺少二硫鍵后不能誘導(dǎo)細(xì)胞空泡化的形成,說(shuō)明二硫鍵對(duì)CARDS毒素結(jié)構(gòu)和功能都具有重要意義。

2.2 作用機(jī)制

2.2.1 CARDS毒素與宿主細(xì)胞相結(jié)合 CARDS毒素主要與宿主細(xì)胞的人表面結(jié)合蛋白受體相結(jié)合,這種結(jié)合是鈣離子依賴性的。因此,對(duì)鈣離子有影響的因素如重金屬等都可能會(huì)對(duì)CARDS毒素與人表面結(jié)合蛋白的結(jié)合以及后續(xù)發(fā)揮毒素作用產(chǎn)生影響[3,8-9]。CARDS 毒素除了與人表面結(jié)合蛋白受體結(jié)合外,還可以與膜聯(lián)蛋白A2 受體呈濃度依賴性結(jié)合[10]。此外,不存在人表面結(jié)合蛋白和膜聯(lián)蛋白A2的情況下CARDS 毒素也能與細(xì)胞相結(jié)合,推測(cè)CARDS毒素還有其他的受體[8]。

2.2.2 CARDS毒素進(jìn)入宿主細(xì)胞后到達(dá)目的地 CARDS毒素進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)首先通過(guò)受體與細(xì)胞表面相結(jié)合,然后主要以網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞機(jī)制為介導(dǎo),以劑量和時(shí)間依賴性的方式進(jìn)入宿主細(xì)胞,并且呈溫度依賴性,CARDS毒素在37 ℃時(shí)內(nèi)在化的效率明顯高于4 ℃時(shí),由于阻斷網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞機(jī)制之后還會(huì)有少量的CARDS 毒素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),可以推測(cè)CARDS 毒素可能還存在其他的途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞[11-13]。

CARDS毒素進(jìn)入宿主細(xì)胞后,依賴于CARDS 毒素268～272位氨基酸之間的KELED 序列逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng),而后發(fā)揮細(xì)胞毒性作用,并且逃脫了溶酶體的降解。KELED 序列突變后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中CARDS毒素含量明顯比未突變的低,并且對(duì)CARDS毒素的細(xì)胞毒性有著顯著影響[12]。

2.2.3 CARDS毒素的毒性特點(diǎn) CARDS毒素的N 末端區(qū)域具有ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性,C末端區(qū)域能誘導(dǎo)細(xì)胞空泡化[5-6],這是呈時(shí)間和劑量依賴性的[12,14]。Kannan等[6]通過(guò)在CARDS 毒素的編碼區(qū)域內(nèi)引入終止密碼子,構(gòu)建CARDS毒素末端截短變體,確定ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的決定性分子位于N 末端;另一方面,缺少C 末端區(qū)域未能誘導(dǎo)細(xì)胞空泡化,說(shuō)明CARDS毒素的C 末端介導(dǎo)細(xì)胞空泡化。

CARDS毒素能夠通過(guò)ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性激活炎性小體,釋放炎癥因子,進(jìn)而引起一系列的炎癥和過(guò)敏反應(yīng)[15]。Kannan和Baseman[4]的另一個(gè)實(shí)驗(yàn)也顯示重組CARDS毒素能使中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞和HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞空泡化,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。另外,次級(jí)內(nèi)體蛋白R(shí)ab9在CARDS毒素誘導(dǎo)細(xì)胞空泡化的過(guò)程中也發(fā)揮了重要作用[13]。

2.2.4 CARDS毒素引起的病理生理變化 CARDS毒素能通過(guò)炎性小體NLRP3和Th2等途徑釋放和增加炎性因子的表達(dá)量,從而引發(fā)各種炎癥和過(guò)敏反應(yīng)。CARDS毒素介導(dǎo)的ADP核糖基化在炎性小體NLRP3的翻譯后修飾和激活過(guò)程中發(fā)揮重要作用,通過(guò)激活NLRP3釋放IL-1β,并且可以誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞自噬[15-16];重組CARDS毒素能誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子IL-4和IL-13的表達(dá)增加30倍,Th2趨化因子CCL17和CCL22 的表達(dá)增加70～80 倍[17];CARDS毒素的表達(dá)量越高,MP 感染的小鼠和患者支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-6等炎性因子的表達(dá)水平也越高[14,18]。CARDS毒素的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性能夠在小鼠中引發(fā)功能性Ig E 反應(yīng),誘導(dǎo)CARDS毒素特異性Ig E和總血清Ig E 含量的升高,而受CARDS 毒素特異性IgE致敏的肥大細(xì)胞會(huì)釋放己糖胺酶[19],直接導(dǎo)致一系列過(guò)敏癥狀的發(fā)生。這些研究表明CARDS毒素通過(guò)介導(dǎo)各種炎癥因子和趨化因子等引發(fā)多種炎癥和過(guò)敏反應(yīng),如中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)性炎癥、嗜酸粒細(xì)胞性炎癥、淋巴細(xì)胞性炎癥以及混合性炎癥等[17,20-21]。

CARDS毒素引起的炎癥和過(guò)敏反應(yīng)會(huì)引發(fā)一系列的病理性改變。有研究顯示,CARDS毒素濃度與MP感染的小鼠肺組織病理學(xué)評(píng)分呈顯著正相關(guān)。在靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型中,暴露于MP和CARDS毒素的狒狒肺部均出現(xiàn)相似的組織病理學(xué)變化,如呼吸道上皮完整性喪失、纖毛停滯、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、胞漿空泡化、細(xì)胞核固縮等,并會(huì)導(dǎo)致類似哮喘的反應(yīng)[15,22],也說(shuō)明CARDS毒素在MP 致病機(jī)制中起主要作用。

3 檢測(cè)方法

CARDS毒素的檢測(cè)方法主要分為兩大類:基因檢測(cè)和蛋白檢測(cè)。檢測(cè)CARDS毒素基因的方法主要是利用各種PCR 方法對(duì)CARDS毒素基因進(jìn)行檢測(cè),如熒光定量PCR;檢測(cè)CARDS毒素蛋白的方法有蛋白質(zhì)印跡、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和抗原捕獲方法等。

王良玉等[23]使用熒光定量PCR 的方法檢測(cè)臨床樣本中的CARDS毒素基因,并用MP 血清學(xué)方法作為對(duì)照,敏感度為83.56%,兩者的符合率為80.85%,敏感度和符合率都比較高。

蛋白質(zhì)印跡和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法都是利用抗原抗體反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè);抗原捕獲測(cè)定法是Kannan等[21]開(kāi)發(fā)的一種定量組織樣品中的CARDS 毒素蛋白水平的方法,用已知量的重組CARDS繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以量化組織樣品中CARDS毒素的量,從而對(duì)MP進(jìn)行定量。

CARDS毒素蛋白檢測(cè)方法比較繁瑣,耗時(shí)比較長(zhǎng),可以對(duì)CARDS毒素蛋白進(jìn)行定量;而CARDS毒素基因檢測(cè)方法,尤其是熒光定量PCR,快速、簡(jiǎn)單,也可以對(duì)CARDS毒素基因定量檢測(cè),但若檢測(cè)樣本來(lái)源于曾經(jīng)感染過(guò)MP的患者,可能出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。這2類方法各有優(yōu)劣,在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中2種方法結(jié)合使用效果可能會(huì)更好。

4 臨床價(jià)值

CARDS毒素的表達(dá)水平與臨床的嚴(yán)重程度相關(guān)。一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)MP 感染患兒在MP 感染急性期CARDS毒素水平最高[24];另有研究證明MP感染的病情危重程度與患者血清CARDS毒素含量呈正相關(guān)[25];而難治性MP 肺炎比非難治性MP 肺炎患者的肺泡灌洗液中CARDS毒素的水平顯著升高[18]。這些研究都說(shuō)明通過(guò)檢測(cè)CARDS毒素基因或蛋白對(duì)MP感染的診斷和評(píng)估具有相當(dāng)大的價(jià)值,尤其是在感染的早期,不僅如此,CARDS毒素的濃度還可提示臨床MP肺炎的病情變化。

對(duì)于MP感染引起哮喘的患者來(lái)說(shuō),檢測(cè)CARDS 毒素間接提示MP的含量,能更好地指導(dǎo)臨床哮喘患者,尤其是難治性哮喘患者的治療[26]。研究表明,MP 與哮喘初始和急性發(fā)作[27]、持續(xù)[28]、加重[29]和惡化[30]息息相關(guān)?；贑ARDS毒素的檢測(cè)方法能快速準(zhǔn)確為臨床MP 感染所致疾病的診斷提供幫助。目前MP的檢測(cè)方法主要有培養(yǎng)、血清學(xué)、分子生物學(xué)方法等。MP 培養(yǎng)法雖然特異性強(qiáng),但由于耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、營(yíng)養(yǎng)要求高等缺點(diǎn),很難廣泛用于臨床[31];目前的金標(biāo)準(zhǔn)是雙份血清學(xué)樣本 (發(fā)病7～10 d左右和間隔2周后)抗體滴度升高4倍以上,耗時(shí)長(zhǎng),臨床適用于回顧性研究[31];分子生物學(xué)方法中常用的靶基因主要有16s RNA 基因、P1蛋白基因、ATP 酶操縱子以及CARDS毒素基因等,有研究顯示以CARDS毒素基因?yàn)槟康幕虻腜CR 檢測(cè)靈敏度高于其他如P1蛋白基因、ATP酶操縱子等序列[12,21-22,32-33],并且通過(guò)對(duì)臨床樣本的檢測(cè),CARDS毒素抗原捕獲測(cè)定法的靈敏度高于任何一種PCR 方法[34-35]。

5 小結(jié)與展望

CARDS毒素所致疾病的病理生理表現(xiàn)與MP 高度相似,為深入理解MP致病機(jī)制提供了進(jìn)一步線索。并且基于CARDS毒素的檢測(cè)方法更加方便快捷,有望成為臨床MP感染尤其是感染早期診斷的新方法,并為難治性哮喘等慢性氣道疾病提供了研究熱點(diǎn)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突