分光光度法在胡蘿卜不同顏色肉質(zhì)根品種生育期內(nèi)天然活性物質(zhì)含量變化研究中的運(yùn)用

華 蕾，王 靜

引言

據(jù)中國(guó)調(diào)味品協(xié)會(huì)（CFAA）統(tǒng)計(jì)，截至2019年我國(guó)食用著色劑產(chǎn)銷(xiāo)總量將達(dá)47.35萬(wàn)t，同比增長(zhǎng)0.34%。當(dāng)前我國(guó)天然色素行業(yè)仍處于粗制階段，合成色素通常具有一定的毒性，無(wú)法滿(mǎn)足消費(fèi)者對(duì)于食品安全提出的要求，如何實(shí)現(xiàn)天然色素的開(kāi)發(fā)與量產(chǎn)成為科研領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。胡蘿卜是一種含有大量類(lèi)胡蘿卜素、葉綠素、花青素等物質(zhì)的蔬菜，其中的天然活性物質(zhì)不僅有利于人體健康，而且還可以從中提煉出天然色素，為胡蘿卜食品的深加工與工業(yè)化生產(chǎn)提供良好條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在試驗(yàn)材料方面，本文選擇4類(lèi)肉質(zhì)根顏色依次為深紅色、紫色、黃色和鮮紅色的胡蘿卜品種作為試驗(yàn)材料，分別記為A-D，其中A為新黑田五寸、B為紫色胡蘿卜、C為托福黑田五寸胡蘿卜、D為紅參1號(hào)胡蘿卜。試驗(yàn)儀器選用德國(guó)梅特勒－托利多PB602-L電子天平（0.01g），上海棱光Gold S53紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)以及打孔機(jī)。試驗(yàn)在石河子大學(xué)設(shè)施生物種苗研發(fā)中心開(kāi)展，試驗(yàn)起止時(shí)間為2016年12月-2018年10月，其中在2016年12月至次年7月主要通過(guò)運(yùn)用多種檢測(cè)方法進(jìn)行胡蘿卜中天然活性物質(zhì)含量的測(cè)定，從中篩選出最優(yōu)檢測(cè)方法；在2018年4月-10月以試驗(yàn)田為基準(zhǔn)播種4類(lèi)品種的胡蘿卜，記錄不同品種胡蘿卜在各生長(zhǎng)期內(nèi)的天然活性物質(zhì)含量，并將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納整理，利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果分析。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本處理方法

將待測(cè)四類(lèi)不同品種的胡蘿卜種子置于25-40℃的水中浸泡12h，將種子與沙子以1∶50的比例進(jìn)行均勻混合，利用開(kāi)溝器以0.4m為間隔在試驗(yàn)田上開(kāi)若干道淺溝，在2018年5月7日10∶00將四類(lèi)種子依次在試驗(yàn)田中進(jìn)行播種，將覆土厚度設(shè)為1-1.5cm，并澆足底水。待6d左右開(kāi)始出苗，14d長(zhǎng)出第一片真葉，在全生育期內(nèi)至少鋤草松土4次、澆水5次，并依照每畝5kg的用量進(jìn)行施肥，使土壤熵值增大、促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)。待播種41d后，以15d為間隔執(zhí)行一次采樣，收集四類(lèi)胡蘿卜品種進(jìn)行清洗、擦干，并將其分成均等的三部分，確保上、中、下部位的韌皮部與木質(zhì)部完全分離，留待后續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定。

1.2.2 試驗(yàn)測(cè)定方法

首先選取β-胡蘿卜素作為標(biāo)樣，以石油醚、無(wú)水乙醇作為分析純進(jìn)行類(lèi)胡蘿卜素的測(cè)定。取胡蘿卜上、中、下部位的碎塊各0.3g置于容量為50ml的三角瓶?jī)?nèi)，以1∶1的比例加入10ml石油醚和無(wú)水乙醇混合溶液，在無(wú)光條件下?lián)u勻并靜置過(guò)夜。量取20mlβ-胡蘿卜素加入2ml三氯甲烷溶液，利用石油醚將其定容至50ml，配制成0.4mg/ml的混合溶液；隨后量取1ml混合溶液，利用石油醚將其定容至10ml后配制成40mg/ml的混合溶液，再依次量取混合溶液利用石油醚定容至4ml，配制出濃度依次為3、4、5、6、8和10mg/ml的溶液；以石油醚為基準(zhǔn)進(jìn)行空白試驗(yàn)，測(cè)得最大吸收峰位于448nm處，因此確定在448nm處進(jìn)行吸光度值的檢測(cè)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[1]。將提取出的β-胡蘿卜素溶液置于光徑為1cm的比色杯中，以1∶1的比例選取石油醚與乙醇混合溶液作為空白，其線(xiàn)性范圍保持在0-10μg/mL范圍內(nèi)，在448nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度測(cè)定，其回歸方程為：

y=0.000 1+0.047 75x（y=1.002 7，n=6）

其次以葉綠素為標(biāo)樣，以95%乙醇為試劑進(jìn)行葉綠素的測(cè)定。取胡蘿卜上、中、下部位碎塊各0.2g置于三角瓶?jī)?nèi)，加入25ml的95%乙醇溶液，在無(wú)光條件下靜置過(guò)夜。將提取出的葉綠素溶液置于比色杯中，以95%乙醇溶液作為空白，分別在波長(zhǎng)為470、649和665nm條件下進(jìn)行吸光度值的檢測(cè)。

最后以花青素為標(biāo)樣，選取15ml的1.5M鹽酸溶液加入85ml的95%乙醇溶液中作為提取劑進(jìn)行花青素的測(cè)定。取胡蘿卜上、中、下部位進(jìn)行打孔處理，在三個(gè)部位各取50片胡蘿卜樣本置于三角瓶?jī)?nèi)，并分別添加20ml提取液，在無(wú)光條件下靜置過(guò)夜。將提取出的花青素溶液置于比色杯中，以提取劑為空白，在530nm波長(zhǎng)條件下進(jìn)行吸光度測(cè)定[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 類(lèi)胡蘿卜素含量

2.1.1 不同品種條件

通過(guò)觀察4類(lèi)胡蘿卜品種的類(lèi)胡蘿卜素含量變化情況可以發(fā)現(xiàn)（單位為mg/100g），品種A的β-胡蘿卜素含量整體呈現(xiàn)為由低到高、保持平緩、再次由低到高的變化特征，其中β-胡蘿卜素含量的峰值150.57mg出現(xiàn)在9月中旬；品種B的β-胡蘿卜素含量呈現(xiàn)為由低到高、略微下降、再次升高、最后下降的變化特征，含量峰值191.01mg出現(xiàn)在9月初；品種C的β-胡蘿卜素含量呈現(xiàn)為由低到高、下降、升高、再次下降的變化趨勢(shì)，但整體變化幅度較小，含量峰值23.97mg出現(xiàn)在7月初；品種D的β-胡蘿卜素含量呈現(xiàn)為由低到高、下降、升高、下降、再次升高的變化趨勢(shì)，含量峰值153.14mg出現(xiàn)在7月下旬。整體來(lái)看，4類(lèi)胡蘿卜品種的β-胡蘿卜素含量均值分別為95.82mg、139.58mg、19.47mg和113.61mg，品種C的含量最低，其余3類(lèi)品種的含量大體保持一致。在5%與1%水平下，品種D與其余3類(lèi)品種的差異均較為顯著。

2.1.2 木質(zhì)部不同部位

以4類(lèi)胡蘿卜品種的木質(zhì)部作為研究對(duì)象，針對(duì)其上、中、下三個(gè)部位的β-胡蘿卜素含量變化情況進(jìn)行分析。品種A、C、D的上部、中部和下部基本呈現(xiàn)為由高到低、再升高的變化趨勢(shì)，品種A的峰值出現(xiàn)在9月中旬，上部最大值為121.34mg；品種C的峰值出現(xiàn)在9月中旬，上部的最大值為23.39mg；品種D的峰值出現(xiàn)在9月中旬，下部最大值為103.05mg。而品種B的上部、中部和下部均呈現(xiàn)出由低到高、再降低的變化趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在9月初，上部最大值為253.79mg。整體來(lái)看，4類(lèi)胡蘿卜品種的β-胡蘿卜素在不同時(shí)間段的上、中部含量均高于下部，并且品種C木質(zhì)部的上中下部含量均值分別為18.51mg、14.11mg和12.31mg，處于4類(lèi)品種中的最低水平；品種B木質(zhì)部的上中下部含量均值分別為153.25mg、112.01mg和99.26mg，處于4類(lèi)品種中的最高水平。在5%水平下，品種A與D的差異性較顯著；在1%水平下，品種A的上部、中部與品種D的上部、中部、下部的差異極顯著。

2.1.3 韌皮部不同部位

以4類(lèi)胡蘿卜品種的韌皮部作為研究對(duì)象，針對(duì)其上、中、下三個(gè)部位的β-胡蘿卜素含量變化情況進(jìn)行分析。品種A、D整體呈現(xiàn)由低至高、降低、再升高的變化趨勢(shì)，其中品種A的峰值出現(xiàn)在9月中旬，上部最大值為217.7mg；品種D的峰值出現(xiàn)在8月中旬，上部最大值為203.86mg。品種B呈現(xiàn)由高到低、升高、再降低的變化規(guī)律，其峰值出現(xiàn)在9月初，中部最高值為241.07mg。品種C呈現(xiàn)由低到高、持續(xù)升高、再降低的趨勢(shì)，峰值出現(xiàn)在8月中旬，上部最高值為36.59mg。整體來(lái)看，4類(lèi)胡蘿卜品種的β-胡蘿卜素在不同時(shí)間段的上部、中部含量均顯著高于下部，其中品種C韌皮部的上中下部含量均值分別為28.58mg、22.01mg和16.76mg，處于4類(lèi)品種的最低水平；其余三類(lèi)品種的β-胡蘿卜素含量均值由高到低依次為品種B、D和A。在5%水平下，品種D的上部、中部、下部與其余3類(lèi)品種的差異較顯著；品種A、B的上中下部與品種C的上部差異不顯著；在1%水平下，品種D的上中下部與其余3類(lèi)品種的差異極顯著，品種A的上部與品種C的下部差異極顯著，品種A、B的上中下部與品種C的上部差異不顯著。

2.2 葉綠素含量

2.2.1 葉綠素a含量變化情況

以4類(lèi)品種肉質(zhì)根的葉綠素a含量變化規(guī)律作為研究對(duì)象（單位為mg/g），觀察時(shí)間為6月下旬至9月中旬。品種A、B的葉綠素a含量基本保持由低到高、降低、升高、再降低的變化趨勢(shì)，其中品種A的峰值出現(xiàn)在7月初，最高值為0.57mg；品種B的峰值也出現(xiàn)在7月初，最高值為0.55mg。品種C、D的葉綠素a含量基本保持由高到低、持續(xù)降低、再升高的變化規(guī)律，其中品種C的峰值出現(xiàn)在6月下旬，最高值為0.88mg；品種D的峰值也出現(xiàn)在6月下旬，最高值為0.56mg。整體來(lái)看，4類(lèi)胡蘿卜品種的葉綠素a含量均值分別為0.42mg、0.35mg、0.31mg和0.28mg；在5%和1%兩種水平下，4類(lèi)品種的葉綠素a含量差異均不顯著。

2.2.2 葉綠素b含量變化情況

針對(duì)4類(lèi)品種肉質(zhì)根的葉綠素b含量變化進(jìn)行分析（單位為mg/g），從中可以觀察到，品種A、C的葉綠素b含量基本保持由高到低、升高、再降低的變化趨勢(shì)，其中品種A的峰值出現(xiàn)在9月中旬，最高值為1.14mg；品種C的峰值出現(xiàn)在6月末，最高值為1.78mg。品種B、C的變化軌跡也保持一致，其中B的峰值出現(xiàn)在9月初，最高值為1.59mg；C的峰值出現(xiàn)在6月末，最高值為1.78mg。整體來(lái)看，4類(lèi)品種的葉綠素b含量均值依次為0.5、0.61、0.62和0.71mg；在5%和1%兩種水平下，4類(lèi)品種的葉綠素b含量差異均不顯著。

2.3 花青素含量

2.3.1 不同品種條件

觀察4類(lèi)品種的花青素含量變化情況，以花青素吸收度作為衡量指標(biāo)（單位為10-2/cm2），其中品種A、B、D均呈現(xiàn)為由低到高、降低、升高、再降低的變化趨勢(shì)，品種C的變化規(guī)律表現(xiàn)為由高到低、升高、降低、再升高，且品種B的花青素含量與其余三種差距較大，峰值105.03AU出現(xiàn)在9月初。從中可以看出，伴隨胡蘿卜肉質(zhì)根顏色的加深，花青素吸收度呈現(xiàn)出逐步提高的趨勢(shì)，其峰值的出現(xiàn)與生育時(shí)間存在密切關(guān)聯(lián)[3]。品種C的肉質(zhì)根為黃色，其花青素吸收度的峰值8.23AU出現(xiàn)在6月末，在胡蘿卜生長(zhǎng)初期肉質(zhì)根尚未膨大、顏色較淺；品種D的肉質(zhì)根為鮮紅色，峰值7.99AU出現(xiàn)在7月初；品種A的肉質(zhì)根為深紅色，峰值5.2AU出現(xiàn)在9月中旬；品種B的肉質(zhì)根為紫色，峰值105.03AU出現(xiàn)在9月初。4類(lèi)品種的花青素吸收度均值依次為4.26、70.5、4.18和4.32AU，在5%水平下B、C、D與A的差異不顯著，在1%水平下A與B、C、D的差異顯著，且依照顏色排序表示為紫色＞鮮紅色＞深紅色＞黃色，由此說(shuō)明肉質(zhì)根顏色越深，胡蘿卜對(duì)于花青素的吸收度越高，因此在胡蘿卜加工環(huán)節(jié)務(wù)必嚴(yán)格加強(qiáng)對(duì)采收時(shí)間的把控，嚴(yán)禁過(guò)早或過(guò)晚采收，為胡蘿卜加工品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)含量提供保障[4]。

2.3.2 木質(zhì)部不同部位

將胡蘿卜木質(zhì)部劃分為三部分，觀察其花青素含量測(cè)定結(jié)果可知，4類(lèi)品種的花青素含量均呈現(xiàn)為由低到高或由高到低、再升高的變化規(guī)律，當(dāng)胡蘿卜進(jìn)入成熟期后其花青素含量均到達(dá)峰值，其中品種A上部為最高值5.54UA；在5%水平下，品種A、B、C的上中下三部與品種D的上部和中部差異不顯著，A的上部與D的下部差異較顯著；在1%水平下，4類(lèi)品種差異均不顯著[5]。

2.3.3 韌皮部不同部位

將胡蘿卜韌皮部劃分為三部分，觀察其花青素吸收度測(cè)定結(jié)果可知，品種B的三部花青素含量均具有一定差異，其中上部呈現(xiàn)由低到高、升高、降低的趨勢(shì)，中部呈現(xiàn)由低到高、緩慢升高、再升高的趨勢(shì)，下部呈現(xiàn)由低到高、緩慢升高、急劇下降的趨勢(shì)，其余3類(lèi)品種的變化幅度不明顯。4類(lèi)品種韌皮部含量排序依次為上、中、下，B的均值由上到下依次為215.89、176.17和121.14AU，保持最高水平；在5%水平下，品種A的上中下部與B、C、D差異顯著，B、C、D的三部差異不顯著；在1%水平下，品種A上部?jī)H與中部差異不顯著，品種A的下部與其他品種及部位差異極顯著，品種B、C、D的差異不顯著。

3 結(jié)論

通過(guò)將上述研究結(jié)果進(jìn)行匯總可知：（1）以β-胡蘿卜素作為類(lèi)胡蘿卜素的代表，4類(lèi)胡蘿卜品種的β-胡蘿卜素峰值分別出現(xiàn)在9月中旬、9月初、7月初和9月中旬，韌皮部的β-胡蘿卜素高于木質(zhì)部，上部、中部平均含量明顯高于下部，由此可以確定9月中旬為胡蘿卜的最佳采收時(shí)間，在深加工環(huán)節(jié)應(yīng)盡量將木質(zhì)部與韌皮部進(jìn)行分離，優(yōu)先提取韌皮部和上部位置的β-胡蘿卜素，保障提升天然活性物質(zhì)的提取效率。（2）4類(lèi)胡蘿卜的葉綠素a含量排序?yàn)镃＞A＞B＞D，峰值分別出現(xiàn)在6月末、7月初、7月初和6月末，說(shuō)明在肉質(zhì)根最初形成階段葉綠素a處于不斷積累的過(guò)程，伴隨生長(zhǎng)期的推移其含量呈逐漸下降趨勢(shì)；而葉綠素b含量為D＞C＞B＞A，其峰值分別出現(xiàn)在9月中旬、6月末、9月初以及9月初，其中品種C與其余3類(lèi)品種的葉綠素含量峰值分別處于肉質(zhì)根形成初期和完全成熟后。（3）4類(lèi)胡蘿卜的花青素含量由高到低依次為B＞A＞D＞C，品種B的花青素含量可達(dá)其余3類(lèi)的20倍，且韌皮部＞木質(zhì)部，說(shuō)明花青素含量與肉質(zhì)根深度成正比。