抗菌人工骨支架材料研究進(jìn)展

伍家毅 李巍明 李夏林 楊大志 易偉宏

感染情況下的骨缺損修復(fù)是臨床難題。感染性骨缺損的形成通常由開放性骨折、骨科手術(shù)后感染以及各類急慢性骨髓炎所致，引起骨缺損處感染的因素包括血運(yùn)缺乏，軟組織丟失，骨缺損區(qū)、內(nèi)固定物表面和人工骨替代物表面易介導(dǎo)細(xì)菌黏附和生物膜形成等[1]。

感染性骨缺損通常采用全身或局部應(yīng)用抗生素控制感染，然后植入骨移植物修復(fù)骨缺損。然而，這些治療方案耗時(shí)較長，需要多次手術(shù)，且療效較差。為了解決這些問題，學(xué)者們開發(fā)了具有抗菌性能的新型人工骨支架材料[2]。

1 抗生素類人工骨支架

抗生素在骨感染缺損修復(fù)中應(yīng)用廣泛。隨著骨組織工程中局部緩釋系統(tǒng)的發(fā)展，各類抗生素已被證實(shí)可裝載于人工骨支架，向骨感染缺損處緩釋藥物。

1.1 四環(huán)素類支架

四環(huán)素類藥物為抑菌類抗菌藥，它們通過抑制微生物蛋白質(zhì)的合成發(fā)揮抗菌活性，其具有抗膠原酶、抗細(xì)菌和促成纖維細(xì)胞的特性，因此也用于骨移植手術(shù)中。四環(huán)素類藥物已知的骨誘導(dǎo)特性是通過增加成骨細(xì)胞活性上調(diào)成骨蛋白(如Ⅰ型膠原)合成，同時(shí)抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收，導(dǎo)致礦化骨基質(zhì)增加，應(yīng)用于人工骨支架中可以進(jìn)一步改善骨再生。

Martin等[3]的研究證實(shí)，添加膠原、米諾環(huán)素和檸檬酸鹽羥基磷灰石納米顆粒的3D打印聚乳酸人工骨支架對金黃色葡萄球菌有抗菌作用。同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)該骨支架還有利于人骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞的存活、增殖，以及成骨相關(guān)基因[Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、骨鈣素(OCN)和骨橋蛋白(OPN)]的表達(dá)。Semyari等[4]采用共沉淀法制備含10%強(qiáng)力霉素的羥基磷灰石納米顆粒，并將其添加于膠原溶液中，以冷凍澆鑄法制備成多孔人工骨支架。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該支架對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均有抑制作用。在大鼠顱骨缺損模型中使用該支架，進(jìn)行組織切片檢查發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)骨形成，骨缺損處完全修復(fù)填充。

1.2 萬古霉素類支架

萬古霉素為治療耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)的首選藥物，且未見其對成骨干細(xì)胞分化有不利影響。萬古霉素與給藥系統(tǒng)結(jié)合顯示出對革蘭氏陽性細(xì)菌生長和生物膜形成的抵抗作用[5]。

Zhou等[6]將含萬古霉素的多孔二氧化硅納米顆粒裝載于明膠多孔支架，該結(jié)合方式可使復(fù)合支架以緩釋方式釋放，其初始爆發(fā)小，可有效抑制隨后的金黃色葡萄球菌生長。他們發(fā)現(xiàn)，載藥復(fù)合支架對骨間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化明顯有利，證實(shí)其具有良好的生物相容性。體內(nèi)研究結(jié)果表明，該復(fù)合支架可在減少細(xì)菌污染的同時(shí)促進(jìn)骨愈合。Cheng等[7]研發(fā)了載萬古霉素的多孔生物玻璃/聚乳酸-羥基乙酸共聚物復(fù)合支架。體外實(shí)驗(yàn)顯示，前72 h萬古霉素從載藥支架迅速釋放，然后為緩坡式緩慢釋放。其初始釋放量較低，58 d后僅23%載量的萬古霉素釋放，并保持8周以上的持續(xù)釋放性能，累計(jì)釋放53%的萬古霉素。將該支架與分離自感染骨缺損中的金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)骨支架菌落數(shù)僅0～1個(gè)；共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其可明顯抑制生物膜形成，但對正常細(xì)胞無不良影響。

1.3 喹諾酮類支架

喹諾酮類藥物是治療骨感染的廣譜抗生素，它們可滲透至骨小梁和皮質(zhì)骨中，且耐藥風(fēng)險(xiǎn)較低，故被選擇用于抗菌骨支架中[8]。

Sreeja等[9]采用表面磷化的苯二甲酸乙二醇酯(P-PET)纖維基質(zhì)制造一種新型骨組織工程支架，該支架涂覆環(huán)丙沙星浸漬的可生物降解的甲基丙烯酸羥乙酯，他們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)該復(fù)合支架具有抗菌和成骨誘導(dǎo)的雙重活性。他們對該支架進(jìn)行洗脫處理，對洗脫液進(jìn)行抗菌圓盤擴(kuò)散測定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，該支架對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌效能與陽性對照組中的抗菌效能相似。場發(fā)射掃描電子顯微鏡圖像顯示，該支架可防止金黃色葡萄球菌黏附，而單純的P-PET支架則不能。

Cicuéndez等[10]設(shè)計(jì)了pH依賴性和局部控制釋放左氧氟沙星的3D納米羥基磷灰石復(fù)合支架。該支架在生理pH值下顯示出持續(xù)遞送左氧氟沙星的能力，當(dāng)pH降低時(shí)(pH 6.7和pH 5.5)，左氧氟沙星傳遞明顯增加。這種pH依賴性的左氧氟沙星釋放，能夠抑制金黃色葡萄球菌生長并破壞預(yù)先形成的生物膜，但對人成骨細(xì)胞無毒性作用。

2 無機(jī)抗菌劑類人工骨支架

長期使用抗生素類人工骨植入可導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，為此，尋求其他抗菌人工骨支架材料成為研究焦點(diǎn)。無機(jī)抗菌劑指利用銀、銅、鋅、鈦、汞、鉛等金屬及其離子的殺菌或抑菌能力制得的抗菌劑。目前，廣泛應(yīng)用于人工骨支架中的無機(jī)抗菌劑包括金屬離子類[如銀離子(Ag+)、銅離子(Cu2+)、鋅離子(Zn2+)等]、氧化物光催化類[如二氧化鈦(TiO2)、氧化鋅(ZnO)]和納米級金屬抗菌劑。

2.1 金屬離子類抗菌劑

金屬離子對細(xì)菌的影響是多方面的，它們通過改變正常生物膜內(nèi)外的極化狀態(tài)形成新的細(xì)胞內(nèi)外離子濃度差，阻礙或破壞維持細(xì)胞生理功能的小分子和大分子物質(zhì)的運(yùn)輸。 一些金屬離子也可以進(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)，使大多數(shù)酶失活，發(fā)揮抗菌效能。

Jiang等[11]通過原位發(fā)泡法制備多孔納米羥基磷灰石/聚氨酯(n-HA/PU)復(fù)合支架，并載入不同含量磷酸銀(Ag3PO4)，載入后支架的孔隙率和力學(xué)性能并無明顯變化。Ag+的釋放隨支架載入Ag3PO4含量和時(shí)間的增加而增加，且可持續(xù)釋放超過3周?？咕鷾y試和細(xì)胞相容性評估顯示，載有3%wt Ag3PO4的n-HA/PU支架對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別達(dá)到96.79%和97.41%，且未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性。

Sehgal等[12]使用可生物降解的結(jié)冷膠和黃原膠聚合物與硫酸鋅離子交聯(lián)，開發(fā)具備抗菌特性的納米復(fù)合材料支架。與僅含結(jié)冷膠和黃原膠聚合物的納米骨支架相比，鋅離子交聯(lián)骨支架可顯著抑制革蘭氏陽性枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性大腸桿菌的生長。

2.2 光催化類抗菌劑

目前，光催化類抗菌劑主要有TiO2、ZnO和三氧化二鐵(Fe2O3)等N型半導(dǎo)體金屬氧化物。其中TiO2的氧化活性較高，穩(wěn)定性也較強(qiáng)，對人體無毒。TiO2在光線照射下產(chǎn)生活性氧，短時(shí)間內(nèi)可完全殺死與其接觸的微生物。由于對紫外線輻射的依賴，TiO2在抗菌骨組織工程中的應(yīng)用常受限。然而近期研究發(fā)現(xiàn)，在無光情況下，于TiO2表面催化分解過氧化氫(H2O2)也能得到活性氧[13]。

Wiedmer等[14]研究無光條件下H2O2催化分解含TiO2溶膠/凝膠涂層的多孔TiO2支架的抑菌作用。他們將發(fā)光菌株Xen43與經(jīng)H2O2處理的溶膠-凝膠涂層表面的多孔TiO2支架共培養(yǎng)，以相對光單位觀察活菌黏附情況。與未暴露于H2O2的樣品相比，經(jīng)H2O2催化分解的TiO2支架相對光單位延遲出現(xiàn)且總峰強(qiáng)度較低。此外，他們還采用共培養(yǎng)后TiO2表面洗脫的菌落形成單位來評估抗菌效能，結(jié)果顯示，經(jīng)30%H2O2預(yù)處理的涂覆溶膠-凝膠TiO2支架表面脫落的活菌數(shù)明顯少于對照組。于感染支架后4 h和12 h進(jìn)行活/死細(xì)胞染色后的掃描電子顯微鏡和熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)涂布后的TiO2支架細(xì)菌數(shù)目少，細(xì)菌均無細(xì)胞活性。

2.3 納米金屬抗菌劑

納米粒子是介于固體與液體間的亞穩(wěn)定中間態(tài)物質(zhì)。納米材料具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，可呈現(xiàn)特殊的物理和化學(xué)特性，具有許多新功能和廣泛的應(yīng)用前景。將金屬離子制成納米級別后，由于其比表面積增大，可以更好地吸附微生物，因此具有更好的抗菌能力。其滅菌機(jī)制包括活性氧產(chǎn)生、陽離子釋放、生物分子破壞、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)耗竭和膜相互作用等[15]。

Deng 等[16]使用銀納米顆粒(AgNPs)錨定于3D打印的聚醚醚酮(PEEK)支架上，將該人工骨支架材料分別與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌一起孵育后均出現(xiàn)5 mm抑菌環(huán)，而對照組僅采用PEEK支架則孵育后未出現(xiàn)抑菌環(huán)。進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)菌生長動力學(xué)定量研究發(fā)現(xiàn)，該支架浸于金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌細(xì)胞懸液中使細(xì)菌的對數(shù)生長期明顯延遲。將該支架暴露于細(xì)菌懸浮液中7 d，通過結(jié)晶紫染色對黏附的生物膜細(xì)菌作定量分析顯示，未見明顯的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌細(xì)菌膜黏附。

3 天然抗菌劑類人工骨

天然生物抗菌劑來源于自然界，其資源極其豐富，根據(jù)來源不同，可將其分為植物源性抗菌劑和動物源性抗菌劑。

動物源性抗菌劑包括氨基酸類、天然肽類、高分子糖類等。殼聚糖因生物相容性好、抗菌性強(qiáng)，成為抗菌人工骨研究的熱點(diǎn)。殼聚糖屬于高分子糖，是甲殼質(zhì)的脫乙酰產(chǎn)物，具有許多帶正電荷的胺，可以與細(xì)菌細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物發(fā)生靜電作用，抑制細(xì)菌生長。但是，殼聚糖在水中溶解性差且機(jī)械性能低限制了它們的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。為此，近期研究進(jìn)行了殼聚糖的化學(xué)修飾，如季銨化、羧甲基化、陽離子化，以獲得理化特性和生物學(xué)特性改善的新材料[17]。Yang等[18]把殼聚糖經(jīng)季銨化形成的羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖(HACC)嫁接到由聚丙交酯-乙交酯(PLGA)和羥基磷灰石(HA)組成的3D打印支架。在體外和體內(nèi)條件下，含有HACC的復(fù)合抗菌骨支架可明顯減少細(xì)菌黏附和生物膜形成。此外，ATP泄漏測定表明，將HACC固定在支架上可以有效破壞細(xì)菌生物膜。

我國傳統(tǒng)中草藥有悠久歷史，該類抗菌劑資源開發(fā)的潛力巨大，穿心蓮、大蒜、金蕎麥、苦木、黃連及黃連素、魚腥草及魚腥草素等都是常用的植物源性抗菌劑。

Huang等[19]將含黃連素的殼聚糖涂布于納米羥基磷灰石/聚酰胺66(n-HA/PA66)人工骨支架。緩釋實(shí)驗(yàn)顯示，黃連素在磷酸鹽緩沖液(PBS)中的最初3 h呈爆發(fā)釋放，持續(xù)釋放可達(dá)150 h。殺菌實(shí)驗(yàn)證實(shí)，遞送系統(tǒng)具有很強(qiáng)的抗菌作用，藥物的最小抑菌質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL。此外，體外生物學(xué)評估表明，涂層支架可作為人骨肉瘤細(xì)胞(MG63)黏附、爬行、生長和增殖的良好基質(zhì)，表明抗菌傳遞系統(tǒng)無細(xì)胞毒性。

丁香酚是從植物中提取的脂類天然化合物，Salerno等[20]用超臨界發(fā)泡成型技術(shù)將丁香酚加入聚(ε-己內(nèi)酯)(PCL)中制備成具有抗菌效能的人工骨支架。丁香酚-PCL骨支架具有細(xì)胞相容性和抗菌活性，可阻止革蘭氏陽性細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)附著，并具有良好的組織整合性。通過濁度測量評估細(xì)菌生長的結(jié)果表明，在所測試的3種菌株中，丁香酚-PCL支架尚不足以實(shí)現(xiàn)完全抑菌作用。然而，在與金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌共同孵育24 h后，丁香酚-PCL支架與PCL支架(陰性對照組)之間的濁度差異明顯，丁香酚-PCL支架的濁度更低。該抗菌性能可能與丁香酚緩釋后局部質(zhì)量濃度較高有關(guān)。

4 結(jié)語

應(yīng)用人工骨組織工程方法治療感染性骨缺損，有望解決傳統(tǒng)治療中存在的問題。在抗菌人工骨領(lǐng)域，開發(fā)出強(qiáng)大、可控制的局部抗菌系統(tǒng)以及可復(fù)制、批量生產(chǎn)的支架生產(chǎn)工藝是研究的關(guān)鍵所在。隨著現(xiàn)代骨組織工程、生物材料等技術(shù)的發(fā)展, 具有抗感染、骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)等多重作用的復(fù)合人工骨或替代物在感染性骨缺損的治療方面將具有良好的前景。