菝葜皂苷元對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29凋亡和自噬的影響

吳源陶，鄒譯嫻，張春虎，王理槐

〔摘要〕 目的 探討菝葜皂苷元（sarsasapogenin， SAR）對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29增殖、凋亡和自噬的影響。方法 將HT-29細(xì)胞分為對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)液）和SAR組（DMEM培養(yǎng)液+DMSO+10、20、30、40、50、60 mg/L SAR溶液）;分別采用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL染色及MDC染色檢測(cè)細(xì)胞的增殖、凋亡及自噬的變化情況;用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 經(jīng)SAR處理后，HT-29細(xì)胞的增殖能力明顯降低（P<0.05），凋亡和自噬水平明顯增加（P<0.05）;與對(duì)照組相比，SAR組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 SAR能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的發(fā)生，其機(jī)制可能與上調(diào)Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 菝葜皂苷元;結(jié)腸癌;大腸癌;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞自噬

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R273? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.001

Effect of Sarsasapogenin on Apoptosis and Autophagy of Colorectal Cancer Lines HT-29

WU Yuantao1， ZOU Yixian1， ZHANG Chunhu2， WANG Lihuai1*

（1. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chines Medicine， Changsha， Hunan 410007， China;

2. Xiangya Hospital， Central South University， Changsha， Hunan 410008， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the effect of sarsasapogenin （SAR） on the proliferation， apoptosis， and autophagy of human colorectal cancer cell HT-29. Methods HT-29 cells were divided into control group （DMEM medium） and SAR group （DMEM medium + DMSO + 10， 20， 30， 40， 50， 60 mg/L SAR solution）. MTT， flow cytometry， TUNEL staining， and MDC staining were used to detect the changes of cell proliferation， apoptosis and autophagy; Western blot method was used to detect the expression levels of Caspase-3， Caspase-9， Beclin-1 and LC3B protein. Results After treatment with SAR， the proliferation ability of HT-29 cells was significantly reduced （P<0.05）， and the level of apoptosis and autophagy increased significantly （P<0.05）. Compared with the control group， the expression levels of Caspase-3， Caspase-9， Beclin-1 and LC3B protein in SAR group were significantly increased （P<0.05）. Conclusion SAR can inhibit the proliferation of colorectal cancer cells， induce apoptosis and autophagy. The mechanism may be related to the up-regulation of Caspase-3， Caspase-9， Beclin-1 and LC3B protein expression levels.

〔Keywords〕 sarsasapogenin; colon cancer; colorectal cancer; cell proliferation; apoptosis; autophagy

結(jié)直腸癌（colorectal cancer， CRC）是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第三位[1]。我國(guó)CRC的發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢(shì)[2]。最新的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，CRC在我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率中位列第三[3]。菝葜，又名金剛藤，為百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根莖，其主要成分是皂苷，且是以菝葜皂苷元（sarsasapogenin， SAR）為主要苷元所衍生的皂苷。研究[4]表明，SAR具有抗衰老、抗炎、降血糖等作用。近年來(lái)研究[5]報(bào)道，SAR還可用于抗腫瘤，如肝癌、胃癌等。但是，關(guān)于SAR對(duì)CRC的作用及其機(jī)制的研究報(bào)道甚少。因此，本研究擬以CRC細(xì)胞株HT-29為研究對(duì)象，通過(guò)觀察菝葜提取物對(duì)CRC細(xì)胞株HT-29凋亡和自噬的影響，探討菝葜提取物對(duì)CRC的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 細(xì)胞株

人CRC細(xì)胞HT-29（批號(hào)：SCSP-5032）購(gòu)于上海生物科學(xué)研究所，在含10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，其內(nèi)加入雙抗，置于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2? 試劑與儀器

SAR（海億欣生物科技公司，批號(hào)：B20025）;DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：12491015）、胎牛血清（批號(hào)：10099-141-FBS）均購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：67-68-5）;Caspase-3抗體（批號(hào)：9669）、Caspase-9抗體（批號(hào)：9504）、Beclin-1抗體（批號(hào)：3738）、LC3B抗體（批號(hào)：2775）均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

超凈工作臺(tái)（蘇州凈化公司，型號(hào)：SW-CJ-IFD）;二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：Shellab 2306）;流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman-Coulter Inc公司，型號(hào)：Cytomics FC500）;全自動(dòng)酶標(biāo)儀（深圳邁瑞公司，型號(hào)：MR-96A）;實(shí)時(shí)定量 PCR 儀（美國(guó) BioRad公司，型號(hào)：S1000）;離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：Medifuge）;熒光顯微鏡（日本Olympus公司，型號(hào)：BX-51）。

1.3? 細(xì)胞分組

將HT-29細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板培養(yǎng)24 h。分為對(duì)照組（DEME培養(yǎng)液）和SAR組（DMEM培養(yǎng)液+DMSO+10、20、30、40、50、60 mg/L SAR溶液），各組培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4? MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取狀態(tài)良好、生長(zhǎng)旺盛的HT-29細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞;以1×105/孔細(xì)胞密度接種至96孔板，常規(guī)培養(yǎng)4 h后分別加入10、20、30、40、50、60 mg/L的SAR，對(duì)照組不加藥;藥物處理24、48、72 h后，開(kāi)始MTT反應(yīng)，酶標(biāo)儀490 nm檢測(cè)OD值。根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5? 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡

將50 mg/L SAR加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)48 h后，胰酶消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞變圓時(shí)，終止消化，依次以預(yù)冷的D-Hanks液及1×binding buffer洗滌細(xì)胞。離心重懸成細(xì)胞懸液。添加10 μL

Annexin V-APC染色液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同組別細(xì)胞的凋亡率。

1.6? MDC染色檢測(cè)細(xì)胞自噬

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，重懸成細(xì)胞懸液。加入50 mg/L SAR培養(yǎng)，2 h后加入6-OHDA，共培養(yǎng)48 h，對(duì)照組不加藥，常規(guī)培養(yǎng)。后按照MDC染色試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)并拍照。檢測(cè)到的高亮點(diǎn)狀熒光代表自噬泡。

1.7? Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)量

用胰酶消化并收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞，加入SDS裂解液提取細(xì)胞總蛋白，后采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。取30 μg蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉液室溫封1 h;用TBST洗膜3次后，加入用TBST稀釋的一抗（Caspase-3為1∶500;Caspase-9為1∶1 000;Beclin-1為1﹕1 000;LC3B為1∶1 000），4 ℃過(guò)夜;用TBST洗膜3次，每次5 min;經(jīng)TBST漂洗后加入相應(yīng)的二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，TBST洗膜3次;加ECL顯影劑，用自動(dòng)凝膠成像分析儀檢測(cè)，采用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。以β-actin為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用“x±s”表示。當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)，組間比較采用one-way ANOVA分析。若方差齊，組間差異比較采用LSD法;若方差不齊，組間差異比較采用Tamhane法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? SAR對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響

SAR能夠抑制HT-29細(xì)胞的增殖，且對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴性。與0 mg/L相比，用50 mg/L SAR干預(yù)48 h后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制（P<0.05）。因此選取50 mg/L SAR進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

2.2? SAR對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，SAR組細(xì)胞早期凋亡率為3.24%，高于對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡率的0.41%（P<0.05）;SAR組細(xì)胞晚期凋亡率為14.36%，高于對(duì)照組細(xì)胞晚期凋亡率的0.66%（P<0.05）。TUNEL染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SAR組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3? SAR對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

與對(duì)照組相比，SAR組Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4? SAR對(duì)HT-29細(xì)胞自噬的影響

與對(duì)照組相比，SAR組可見(jiàn)到明顯的自噬囊泡形成。見(jiàn)圖4。

2.5? SAR對(duì)HT-29細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響

與對(duì)照組相比，SAR組細(xì)胞Beclin-1和LC3B蛋白表達(dá)增多（P<0.05）。見(jiàn)圖5。

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，CRC已成為全球第四大致命癌癥[6]。根據(jù)中國(guó)國(guó)家癌癥中心發(fā)布的《2018年國(guó)家癌癥報(bào)告》顯示，CRC在中國(guó)癌癥發(fā)病率中排名第三[3]。因此，迫切需要尋找一種有效治療CRC的臨床藥物[7]。SAR可通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，且由于其較高的安全性，使SAR的抗CRC癌活性已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一[5]。

凋亡是細(xì)胞為清除體內(nèi)異常或受損細(xì)胞自發(fā)啟動(dòng)的程序性保護(hù)機(jī)制，在細(xì)胞發(fā)育和代謝中起著至關(guān)重要的作用[8-9]。臨床上通過(guò)外部干預(yù)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為治療腫瘤的重要途徑。有學(xué)者探討了SAR對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)SAR能夠誘導(dǎo)HepG2凋亡[9-10]。廖子君等[10-12]研究發(fā)現(xiàn)，SAR能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡，而不會(huì)影響健康細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)能夠上調(diào)Bax蛋白、下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。在本研究中，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，SAR組HT-29細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0.05）。TUNEL染色結(jié)果同樣提示SAR可以誘導(dǎo)人CRC HT-29細(xì)胞凋亡（P<0.05）。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，SAR干預(yù)可上調(diào)HT-29細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)（P<0.05）。凌博凡等[13]研究發(fā)現(xiàn)，SAR干預(yù)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞48 h后能夠誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，該效應(yīng)發(fā)生的同時(shí)線粒體膜電位會(huì)出現(xiàn)下調(diào)改變，提示誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與線粒體通路的調(diào)控有關(guān)。

自噬是真核生物體細(xì)胞內(nèi)重要的自我降解和再循環(huán)機(jī)制。生理狀態(tài)下，自噬通過(guò)清除自身有害物質(zhì)（老化及死亡的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器）而維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，對(duì)機(jī)體細(xì)胞發(fā)揮著保護(hù)作用[14-15]。當(dāng)自噬發(fā)生異常時(shí)，細(xì)胞內(nèi)原有的穩(wěn)態(tài)會(huì)被打破，而促進(jìn)腫瘤發(fā)生與發(fā)展[16-17]。Beclin-1基因是自噬的特異性相關(guān)基因，由其編碼的Beclin-1蛋白被認(rèn)為是腫瘤抑制蛋白，能夠調(diào)節(jié)自噬過(guò)程，其機(jī)制可能是與ClassⅢPI3K相結(jié)合參與自噬泡的形成[18]。LC3B作為細(xì)胞自噬的特異性蛋白，其含量與自噬小體數(shù)量呈正相關(guān)，因而被廣泛運(yùn)用于自噬研究[19-20]。本研究運(yùn)用MDC染色法研究SAR對(duì)細(xì)胞自噬的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SAR組可見(jiàn)到明顯的自噬囊泡，且經(jīng)SAR處理的HT-29細(xì)胞中，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3B顯著增多（P<0.05），提示SAR可激活HT-29細(xì)胞的自噬。

綜上所述，SAR可能通過(guò)調(diào)控Caspase-3、Caspase-9、Beclin-1及LC3B蛋白的表達(dá)水平發(fā)揮抑制HT-29細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬的作用。但是其具體深層機(jī)制需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行研究。本研究為菝葜皂苷的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和為CRC的臨床治療提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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（本文編輯? 匡靜之 周? 旦）