金屬抗菌肽SIF4在人工模擬食品體系中的抑菌穩(wěn)定性

肖懷秋，李玉珍，林親錄，趙謀明，劉軍，周全

1(湖南化工職業(yè)技術(shù)學院 制藥與生物工程學院，湖南 株洲，412000) 2(中南林業(yè)科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙，410004)3(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510000)

食品富含碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)成分，在加工、流通及貯藏等環(huán)節(jié)極易滋生微生物并導致食品發(fā)生腐敗變質(zhì)，既影響食品的營養(yǎng)價值、外觀質(zhì)量及風味品質(zhì)，還可能產(chǎn)生對人體健康有潛在危害的生物毒素。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有10億例因食源性致病菌引起的疾病，特別是金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[1]。傳統(tǒng)熱處理殺菌方式對食品熱敏性營養(yǎng)成分、生物活性組分及色香味等可產(chǎn)生潛在不利影響，使食品失去原有新鮮度和(或)產(chǎn)生異味[2]，使用人工防腐保鮮劑常存在潛在“三致”危害，因此，在保留食品原有風味、新鮮度及保證安全前提下，使用安全高效和新穎的抑菌技術(shù)成為食品防腐保鮮及公共衛(wèi)生安全領(lǐng)域重要的研究課題。抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)具有熱穩(wěn)定性好、抑菌活性高、特異性強、對哺乳動物細胞毒副作用少且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢，可用于食品致病菌與腐敗微生物的增殖抑制[3]，部分抗菌肽還兼具抗氧化等生物活性[4]，有望作為一種新型抑菌劑用于食品防腐保鮮及食源性致病菌抑制[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，金屬抗菌肽SIF4在0.2×10-3g/L(最低抑菌濃度)時可破壞S.aureus細胞膜完整性，表現(xiàn)較好抑菌活性[3]并具有較好抗氧化活性[4]，可通過抑制微生物增殖和防止食品組分氧化協(xié)同作用實現(xiàn)食品的防腐保鮮，但其在食品加工體系中的抗菌穩(wěn)定性衍變機制尚不明確。本試驗以S.aureus為指示菌，系統(tǒng)研究了金屬抗菌肽SIF4在人工模擬食品乳化體系、增稠體系、加酶體系、高糖和高鹽體系中抗菌活性變化，為其在食品防腐保鮮中的應(yīng)用研究奠定良好理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

金屬抗菌肽SIF4由課題組制備；金黃色葡萄球菌ATCC25923，由菌種保藏中心獲得；木瓜蛋白酶(papain)、菠蘿蛋白酶(bromelain)、堿性蛋白酶(alkaline protease，AkP)、中性蛋白酶(neutral protease，NP)、酸性蛋白酶(acid protease，AcP)、復合風味蛋白酶(complex flavor protease，CFP)，東恒華道生物科技有限公司；胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(trypsin)，龐博生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

HERMLE Z323K冷凍離心機，德國Hermle公司；LDZX-40SAI立式蒸氣滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BBS-SSC超凈工作臺，濟南騰覽儀器有限公司；DH-360電熱恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司；DK-98-11A型電熱恒溫水浴箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 金屬抗菌肽SIF4制備工藝

稱取0.01 g花生肽亞鐵加入至1 000 mL胃仿生消化液中，于(37±0.5) ℃、100 r/min仿生消化2 h，0.5 mol/L NaOH調(diào)pH至7.6終止胃仿生消化，用腸仿生消化液(37±0.5) ℃、50 r/min仿生十二指腸消化1 h，調(diào)pH至6.8并于(37±0.5) ℃、50 r/min繼續(xù)仿生小腸消化2 h，收集仿生消化液冷凍干燥備用[6]。

1.2.2 抑菌穩(wěn)定性評價(相對抑菌活性)

準確吸取0.1 mLS.aureus菌液(6×108CFU/mL)均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面，將滅菌后的牛津杯置于培養(yǎng)皿中并加入供試品(0.2×10-3g/L SIF4或模擬食品體系處理后的SIF4)0.1 mL。為使試液充分擴散至瓊脂層，將培養(yǎng)皿4 ℃放置2 h后于37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測定抑菌圈直徑[3]。抑菌穩(wěn)定性以相對抑菌活性進行評價。

1.2.3 模擬食品乳化體系

將2.0×10-3g/L SIF4與10～50 g/L的硬脂酰乳酸鈉(sodium stearyl lactate，SSL)、硬脂酰乳酸鈣(calcium stearyl lactate，CSL)、雙乙酰酒石酸單甘油酯(diacetyl tartaric acid esters of monoglycerids，DATEM)、蒸餾單甘酯(distilled monoglyceride，DMG)、脂肪酸蔗糖酯(sugar esters，SE)、聚甘油酯(polyglyceryl ester of fatty acid，PGFA)、月桂酸單甘油酯(glycerol Monolaurate，GML)、大豆磷脂(soybean lecithin，SL)和十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfonate，SDS)等乳化劑混勻(終質(zhì)量濃度為0.2×10-3g/L，下同)以構(gòu)建模擬食品乳化體系，室溫下放置5 h，測定模擬乳化體系處理前后抑菌圈平均直徑，計算相對抑菌活性以評價抑菌穩(wěn)定性。

1.2.4 模擬食品增稠體系

將2.0×10-3g/L SIF4與1～5 g/L的明膠(gelatin)、羧甲基纖維素鈉(carboxymethyl cellulose sodium，CMC-Na)、瓊脂(agar)、阿拉伯膠(gum Arabic，GA)、海藻酸鈉(sodium alginate，SA)、果膠(pectin)、黃原膠(xanthan gum，XG)、卡拉膠(carrageenan，CG)和海藻酸丙二醇酯(propylene glycol alginate，PGA)等增稠劑混勻以構(gòu)建模擬食品增稠體系，室溫下放置5 h， 測定模擬增稠體系處理前后抑菌圈平均直徑，計算相對抑菌活性以評價抑菌穩(wěn)定性。

1.2.5 模擬食品加酶體系

參考KIM等[7]和李心丹等[8]方法并稍做修改。將2.0×10-3g/L SIF4與10～50 g/L的含蛋白酶懸液混勻以構(gòu)建模擬食品加酶體系，調(diào)整模擬加酶體系溫度與pH至該酶最適條件(表1)并保溫2 h， 100 ℃滅酶5 min，調(diào)pH至7.0，測定模擬加酶體系處理前后抑菌圈平均直徑，計算相對抑菌活性以評價抑菌穩(wěn)定性。

表1 模擬食品加酶體系用酶最適條件

1.2.6 模擬食品高糖體系

將2.0×10-3g/L SIF4與100～300 g/L的蔗糖溶液混勻以構(gòu)建模擬食品高糖體系，室溫下放置5 h，測定模擬高糖體系處理前后抑菌圈平均直徑，計算相對抑菌活性以評價抑菌穩(wěn)定性。

1.2.7 模擬食品高鹽體系

將2.0×10-3g/L SIF4與100～300 g/L的NaCl溶液混勻以構(gòu)建模擬食品高鹽體系，室溫下放置5 h，測定模擬高鹽體系處理前后抑菌圈平均直徑，計算相對抑菌活性以評價抑菌穩(wěn)定性。

1.2.8 試驗數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以平均值±標準偏差(n=3)表示，僅進行組間均數(shù)差異多重比較，采用SPSS Statistics 25.0進行單因素方差檢驗，方差齊性時采用最小顯著性差異法，非齊性時使用塔姆黑尼T2方法[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 在模擬食品乳化體系中的抗菌活性穩(wěn)定性

乳化劑是面包和蛋糕等食品加工中起穩(wěn)定乳化、分散和潤滑等作用的添加劑[9]，可與面粉中淀粉和蛋白質(zhì)等形成復雜復合體并起到增強面筋、提高加工性能、改善面包組織和延長保鮮期等作用[10]。SIF4在模擬食品乳化體系中抗菌穩(wěn)定性結(jié)果如圖1所示。

圖1 在模擬食品乳化體系中的穩(wěn)定性

由圖1可看出，在硬脂酰乳酸鈉、硬脂酰乳酸鈣和雙乙酰酒石酸單甘油酯等模擬食品乳化體系中，金屬抗菌肽SIF4抑菌活性與對照組差異均不顯著(P>0.05)， 但經(jīng)大豆磷脂模擬食品乳化體系處理后，抑菌活性與對照組差異顯著(P<0.05)，與CNZLE等[11]和王美姿等[12]結(jié)論一致，可能是由于在疏水和靜電作用下，乳化劑與蛋白肽類的結(jié)合影響抑菌活性[11]；在SDS模擬食品乳化體系中，試驗組抑菌活性比對照組顯著降低(P<0.05)，可能是因為SDS在溶液中可電離出十二烷基硫酸根離子和Na+，并使蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵打開，十二烷基硫酸根離子為疏水性較強烴鏈，可插入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部或與疏水氨基酸形成強負電荷復合物并引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變。金屬抗菌肽SIF4為陽離子抗菌肽[3]，可與SDS結(jié)合形成帶負電荷復合物，且分子間靜電荷斥力超過抗菌肽與細胞膜磷脂靜電吸附力，阻止抗菌肽易位到細胞內(nèi)膜[13]，降低其抗菌活性。在上述模擬食品乳化體系中，SIF4可保持較好抑菌活性，可用于面包和蛋糕等食品防腐保鮮。且具有較好脂質(zhì)抗氧化活性[4]，可通過抑菌和防止食品脂質(zhì)氧化協(xié)同效應(yīng)實現(xiàn)面包和蛋糕等食品的防腐保鮮。

2.2 在模擬食品增稠體系中的抗菌活性穩(wěn)定性

增稠劑是用于增加和改善果凍、軟糖等凍膠類食品黏稠度和流態(tài)、色香味和穩(wěn)定性并保持潤滑適口感的添加劑[14]，SIF4在模擬食品增稠體系中的抗菌穩(wěn)定性變化如圖2所示。

由圖2可看出，在以明膠、CMC-Na、瓊脂、阿拉伯膠、海藻酸鈉、果膠、黃原膠和卡拉膠等構(gòu)建的模擬食品增稠體系中，SIF4抑菌活性與對照組均無顯著差異(P>0.05)，可通過抑制果凍、調(diào)味糖漿和軟糖等凍膠類食品中致病與腐敗微生物增殖延長食品的保質(zhì)期與貨架期。

圖2 在模擬食品增稠體系中的穩(wěn)定性

2.3 在模擬食品加酶體系中的抗菌活性穩(wěn)定性

在焙烤食品、釀造食品和肉類食品加工過程中常添加蛋白酶制劑來改善加工特性或食品風味[15]。蛋白酶制劑添加對抗菌肽抑菌活性影響多樣，如抗菌肽K11在蛋白酶質(zhì)量濃度達到9 g/L時抑菌活性基本不受影響[16]，而抗菌肽garviecin LG34在蛋白酶質(zhì)量濃度為5 g/L時極易被水解而導致抗菌活性減弱或消失[17]。SIF4在模擬食品加酶體系中的抗菌穩(wěn)定性變化如圖3所示。

圖3 在模擬食品加酶體系中的穩(wěn)定性

由圖3可看出，SIF4在以木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和堿性蛋白酶等供試蛋白酶構(gòu)建的模擬食品加酶體系中抑菌活性與對照組無顯著差異(P>0.05)，說明SIF4具有較好的蛋白酶耐受性，主要是緣于金屬抗菌肽SIF4的配位螯合載體為低分子質(zhì)量多肽[6]，與王美姿等[12]和杜芬等[18]報道相似。因此，SIF4可用于焙烤食品、釀造食品和肉類食品等常見含蛋白酶加工食品的防腐保鮮。

2.4 在模擬食品高糖體系中的抗菌活性穩(wěn)定性

果脯和蜜餞等食品常通過提供高糖環(huán)境來抑制微生物生長而實現(xiàn)長時間保藏，但高糖食品仍有部分微生物可以生長，因此，對這些極端食品中應(yīng)用的抗菌劑生物屬性要求更高。SIF4在模擬食品高糖體系中抗菌穩(wěn)定性結(jié)果如圖4所示。

圖4 在模擬食品高糖體系中的穩(wěn)定性

由圖4可看出，SIF4在不同含糖量的模擬食品含糖體系中抑菌活性變化與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)，在300 g/L含糖量的模擬食品高糖體系中仍保持較高抑菌活性，說明模擬食品高糖體系對抑菌活性影響較少，SIF4可用于果脯、蜜餞及罐頭等高糖食品的防腐保鮮。

2.5 在模擬食品高鹽體系中的抗菌活性穩(wěn)定性

豆瓣醬、泡菜、魚(蝦)醬、腌蛋、榨菜和腐乳等食品常通過高鹽環(huán)境來延長保質(zhì)期[19]，但高鹽食品仍存在諸如葡萄球菌屬等耐鹽微生物生長的情況[20]，存在食源性致病微生物中毒的風險[21]。如谷羚毓[22]對腌蛋腐敗鹽水中耐鹽菌和嗜鹽菌多樣性分析發(fā)現(xiàn)，12株耐鹽腐敗菌中有7株為葡萄球菌屬，占比達到58.33%。SIF4在模擬食品高鹽體系中抗菌穩(wěn)定性如圖5所示。由圖5可看出，在模擬食品高鹽體系中SIF4抑菌活性與對照組無顯著差異(P>0.05)，在300 g/L含鹽模擬體系中仍保持較高抑菌活性。

圖5 在模擬食品高鹽體系中的穩(wěn)定性

耐鹽腐敗細菌細胞壁中沒有肽聚糖，但富含酸性糖蛋白以形成負電荷區(qū)域吸引Na+形成離子鍵來穩(wěn)定細胞壁結(jié)構(gòu)[22]，厭氧條件下光照培養(yǎng)可在細胞膜上形成斑狀紫膜(可占到細胞膜50%)，紫膜中有負電性磺化糖蛋白亞基[23]，因此，耐鹽細菌表面呈負電荷。SIF4可與耐鹽細菌表面的酸性糖蛋白及紫膜等負電荷基團結(jié)合，還可通過靜電吸附與膜表面酸性磷脂結(jié)合，或通過疏水區(qū)域與細胞膜兩性離子磷脂表面聚集并富集于膜表面[24]，或與負電荷細胞外膜脂多糖結(jié)合形成肽-脂復合物并形成跨膜通道破壞細胞膜完整性[25]，從而發(fā)揮良好抑菌活性，因此，可用于豆瓣醬和泡菜等高鹽食品的防腐保鮮。

3 結(jié)論

食品受微生物污染后，其營養(yǎng)價值、風味及食品安全等均受到影響，抑制致病微生物或腐敗微生物在食品中的增殖可實現(xiàn)食品的抗菌保鮮。研究發(fā)現(xiàn)，除大豆磷脂與SDS模擬食品乳化體系外，金屬抗菌肽SIF4抑菌活性與對照組均無顯著性差異(P>0.05)，SIF4作為一種新型食品抗菌劑，在不同模擬食品體系中均保持較好的抗菌穩(wěn)定性，可用于需乳化加工食品、增稠食品、含酶加工食品、高糖及高鹽食品等不同類別食品的抗菌保鮮，在食品防腐保鮮領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。