高效液相色譜法測定煙草中煙堿含量

錢建瑞,楊清山,,栗 星,張曉芳,程遠欣*

(1.晨光生物科技集團股份有限公司,邯鄲 057250; 2.河北晨光檢測技術(shù)服務(wù)有限公司,邯鄲 057250)

煙堿,又稱尼古丁,是煙草和卷煙的主要成分之一,也是衡量煙草和卷煙質(zhì)量水平的一個重要指標,直接影響吸食者的生理滿足程度和健康,因此準確測定煙堿的含量具有重要意義。煙堿的測定方法有紫外分光光度法[1]、絡(luò)合分光光度法[2]、液相色譜法[2-8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2]、氣相色譜法[2,9-11]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2,12]、毛細管電泳法[2]、電化學(xué)法[2]等。分光光度法操作簡單,但準確度較低;色譜-質(zhì)譜法檢測靈敏度和穩(wěn)定性較好,但設(shè)備價格昂貴,不適合在行業(yè)內(nèi)推廣。

目前,煙草行業(yè)標準YC/T 246－2008《煙草及煙草制品煙堿的測定 氣相色譜法》,國家標準GB/T 23355－2009《卷煙總粒相物中煙堿的測定 氣相色譜法》以及GB/T 23225－2008《煙草及煙草制品總植物堿的測定 光度法》中測定煙堿含量的方法主要存在兩方面的問題:一是前處理過程(包括振蕩、液液萃取、濃縮、復(fù)溶)繁瑣,且操作耗時長;二是測定結(jié)果的誤差較大。為降低測定結(jié)果的誤差,提高分析效率,實現(xiàn)對煙草中煙堿快速準確測定,本工作采用超聲提取法,建立了高效液相色譜法(HPLC)測定煙草中煙堿含量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Alliance E2695型高效液相色譜儀,配紫外檢測器;KQ-400B型超聲波清洗儀;HY-4型多功能振蕩器;FW-100型萬能粉碎機。

煙堿標準儲備溶液:稱取煙堿標準物質(zhì)20 mg(精確至0.01 mg),用甲醇稀釋并定容至25 mL容量瓶中,充分搖勻,配制成質(zhì)量濃度為800 mg·L－1的煙堿標準儲備溶液。

含0.2%(體積分數(shù),下同)三乙胺的0.02 mol·L－1磷酸鹽緩沖液:稱取2.20 g磷酸二氫鈉和1.07 g磷酸氫二鈉,加入1 L水和2 mL三乙胺,搖勻,用磷酸調(diào)節(jié)溶液p H至6.0,用0.22μm濾膜過濾,濾液經(jīng)超聲脫氣后備用。

煙堿標準物質(zhì)的純度不小于99%;甲醇為色譜純;磷酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、三乙胺均為優(yōu)級純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫40℃;環(huán)境溫度20～26℃;流動相為體積比 40∶60 的甲醇-含 0.2% 三乙胺的0.02 mol·L－1磷酸鹽緩沖液(p H 6.0)的混合液;流量1.0 mL· min－1;進樣量 10μL;檢測波長259 nm。

1.3 試驗方法

將樣品粉碎后過40目(孔徑0.425 mm)篩網(wǎng),稱取粉碎后的樣品0.5 g(精確到0.1 mg),用含0.1 mol·L－1氫氧化鈉的75%(體積分數(shù),下同)甲醇溶液溶解并定容至100 mL,超聲提取30 min,按照儀器工作條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照試驗方法對煙草樣品進行測定,所得色譜圖見圖1。

圖1 煙草樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of tobacco sample

2.2 提取方法和提取時間的選擇

以實際煙草樣品(煙堿參考值為19.1 mg·g－1)為研究對象,考察了不同提取方法(索氏提取[6]、超聲提取和振蕩提取[11])和提取時間(30,60,90,120 min)對樣品中煙堿提取量的影響,結(jié)果見表1。

表1 提取方法和提取時間對樣品中煙堿提取量的影響Tab.1 Effect of extraction method and extraction time on extracting amount of nicotine in sample

結(jié)果表明,采用索氏提取和振蕩提取法提取30 min時,煙堿的提取量分別為11.7,10.5 mg·g－1,提取率分別為61%和55%;采用超聲提取法提取30 min時,煙堿的提取量為18.9 mg·g－1,提取率達99%;當超聲提取90 min時,煙堿可被完全提取。為提高分析效率,試驗選擇提取方法為超聲提取,提取時間為30 min。

2.3 提取劑的選擇

試驗考察了不同提取劑[甲醇、50%(體積分數(shù),下同)甲醇溶液、含0.1 mol·L－1氫氧化鈉的50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、含0.1 mol·L－1氫氧化鈉的75%甲醇溶液、含0.1 mol·L－1氫氧化鈉的甲醇溶液、0.01 mol·L－1氫氧化鈉溶液、0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液、95%(體積分數(shù),下同)乙醇溶液]對樣品中煙堿提取量的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 提取劑對樣品中煙堿提取量的影響Fig.2 Effect of extractant on extracting amount of nicotine in sample

結(jié)果表明,以含0.1 mol·L－1氫氧化鈉的75%甲醇溶液為提取劑時,煙堿的提取效果較好,這是由于堿性溶液可以破壞植物細胞壁和細胞膜,使煙堿更容易被提取出來;但以0.01,0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液為提取劑時,煙堿的提取量均有所減少,可能是由于水相比例增大后,樣品粉末的分散性變差,導(dǎo)致煙堿的提取率降低。因此,試驗選擇提取劑為含0.1 mol·L－1氫氧化鈉的75%甲醇溶液。

2.4 稱樣量的選擇

試驗考察了樣品稱樣量為0.1,0.2,0.5,1.0 g時對煙堿提取率的影響。結(jié)果表明,當稱樣量為0.1～0.5 g時,煙堿的提取率較高,而且基本保持不變;當稱樣量為1.0 g時,煙堿的提取率明顯降低。為保證煙堿的提取效果,同時兼顧標準曲線的線性范圍,試驗選擇樣品稱樣量為0.5 g。

2.5 標準曲線和檢出限

移取適量的煙堿標準儲備溶液于一組容量瓶中,用甲醇逐級稀釋,配制成煙堿質(zhì)量濃度為3.00,6.00,12.5,25.0,50.0,100 mg·L－1的煙堿標準溶液系列,按照儀器工作條件進行測定。以煙堿的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果顯示,煙堿質(zhì)量濃度在3.00～100 mg·L－1內(nèi)與其對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝1.023×107x－8.752×103,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

以3倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(3S/N),結(jié)果得煙堿的檢出限為0.5 mg·L－1。

2.6 精密度試驗

采用氣相色譜法(YC/T 246－2008)、分光光度法(GB/T 23225－2008)及本法對4個不同來源的煙草樣品進行測定,計算測定值的日內(nèi)(n＝6)和日間(n＝9)相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果Tab.2 Results of test for precision

結(jié)果顯示,氣相色譜法的日內(nèi)RSD為0.58%～1.8%,日間 RSD為1.4%～2.5%;分光光度法的日內(nèi) RSD 為 1.7% ～2.2%,日間 RSD 為 2.0% ～2.8%;本法的日內(nèi) RSD 為 0.47% ～1.1%,日間RSD為0.44%～0.97%,表明本法精密度良好。原因可能是:氣相色譜法在測定過程中振蕩提取操作相對復(fù)雜,多個提取劑的加入以及振蕩不充分均會造成結(jié)果的不穩(wěn)定;分光光度法是通過水蒸氣蒸餾進行提取,提取過程的穩(wěn)定性較差;而本法采用超聲提取,使用的提取劑種類少,操作步驟簡單,結(jié)果穩(wěn)定性好。

2.7 回收試驗

按照試驗方法對煙草樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗,結(jié)果見表3。

表3 回收試驗結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of test for recovery(n＝6)

2.8 樣品分析

采用氣相色譜法(YC/T 246－2008)、分光光度法(GB/T 23225－2008)及本法對4個不同來源的煙草樣品進行測定,每個樣品平行測定6次,計算測定值的RSD,結(jié)果見表4。

表4 樣品分析結(jié)果(n＝6)Tab.4 Analytical results of samples(n＝6)

結(jié)果表明,與氣相色譜法的測定值相比,本法測定值偏高;而與分光光度法相比,兩種方法所得測定值基本一致,而本法的RSD更低。這是由于氣相色譜法的前處理步驟復(fù)雜,振蕩提取效果較差,導(dǎo)致結(jié)果偏低;而分光光度法采用水蒸氣蒸餾提取,穩(wěn)定性較差,導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。

本工作以含0.1 mol·L－1氫氧化鈉的75%甲醇溶液為提取劑,建立了超聲提取-HPLC測定煙草中煙堿含量的方法,該方法操作簡單,穩(wěn)定性好,提取率和精密度均優(yōu)于 YC/T 246－2008、GB/T 23225－2008,可用于大批量樣品的測定。