黃皮根中歐前胡素的提取及含量測定

陸崢琳，黃瑞松，吳氏海燕

（1.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧 530001；2.廣西醫(yī)科大學藥學院，南寧 530022）

黃皮根來源于蕓香科植物黃皮（Clausena lansinm）的干燥根。黃皮在中國南方多地均有栽培［1］，黃皮果實為大眾所喜食的果品，除此之外民間還以黃皮的根、葉、果、果核等入藥［2，3］。黃皮根性辛、微苦，溫，具有行氣止痛之功，可用于治療氣滯胃痛、腹痛、疝痛、風濕骨痛、痛經(jīng)、黃疸、瘧疾［4-8］。關于黃皮根的研究不多。文獻記載［4］黃皮根中含歐前胡素、去氫印黃皮內酯、8-牻牛兒氧基補骨脂素和倍半萜酮右旋日本刺參萜酮等成分。其中，歐前胡素又名歐前胡內酯、歐芹屬素乙、前胡內酯、白芷乙素，是線性呋喃香豆素類化合物，具有抑制癲癇發(fā)作、擴張血管、抑制心肌肥大、抑制腫瘤細胞增殖、抗微生物、影響新陳代謝酶活性等多種藥理作用［9，10］。目前尚未見有黃皮根中歐前胡素含量測定的報道，本研究采用單因素試驗和正交設計對黃皮根中歐前胡素提取條件進行優(yōu)化，建立了黃皮根中歐前胡素含量的高效液相色譜測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

黃皮根（1號2016年1月6日采于廣西隆安縣龍虎山景區(qū)；2號2016年2月18日采于廣西鳳山縣鳳城鎮(zhèn)；3號2016年4月1日采于廣西隆安縣那桐鎮(zhèn)），3批黃皮根樣品對應的帶花臘葉標本經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學韋松基教授及廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為蕓香科植物黃皮；歐前胡素對照品（批號110826-201415，純度為99.7%，供含量測定用），中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈色譜純，德國Merck公司，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（帶自動進樣器及VWD檢測器），美國安捷倫科技公司；LC-20 AT高效液相色譜儀（帶自動進樣器、二極管陣列檢測器）、UV-2401PC紫外-可見分光光度計，日本島津公司；KQ-3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆明市超聲儀器有限公司；XS205十萬分之一電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；EASYPUREⅡ超純水器，美國熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

1）色譜柱的選擇。在其他色譜條件相同的情況下，分別采用島津C18、賽芬C18和菲羅門Gemini NX C1（8規(guī)格均為5 μm，4.6 mm×250 mm）3根不同色譜柱測定黃皮根樣品（2號），比較其分離效果。

2）流動相的選擇。在同一色譜條件下，分別對甲醇-水（55∶45）、甲醇-水（60∶40）以及乙腈-水（55∶45）3個流動相系統(tǒng)進行試驗。

3）分析波長的選擇。取歐前胡素對照品的甲醇溶液，經(jīng)UV-2401PC紫外-可見分光光度計在190～400 nm進行紫外光譜掃描，確定歐前胡素的最大吸收波長。

1.3.2 供試品溶液制備方法的研究

1）單因素試驗。以歐前胡素含量為指標，考察不同提取溶劑及不同提取方法的效果。歐前胡素為呋喃香豆精類，結合其化學性質及參考有關文獻［11-13］，擬定提取溶劑考察甲醇、乙醇，提取方式考察超聲處理、加熱回流。精密稱取黃皮根（2號）粉末4份，每份約0.5 g，精密加入溶劑15 mL，密塞后稱定重量。以甲醇超聲處理、乙醇超聲處理、甲醇加熱回流、乙醇加熱回流提取30 min，靜置放冷，用相應的溶劑補足減少的重量，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。分別精密吸取上述供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀測定。

2）正交設計優(yōu)化試驗。依據(jù)單因素試驗結果，對藥材破碎度、溶劑體積分數(shù)、提取時間進行三因素三水平考察，因素與水平見表1。以歐前胡素的含量為考核指標，采用L9（34）正交設計安排試驗。

表1 正交試驗設計因素水平

1.3.3 方法學考察

1）專屬性試驗。精密稱取歐前胡素對照品適量，加甲醇制成濃度為30 μg/mL的溶液，作為對照品溶液；精密稱取黃皮根粉末0.5 g，按供試品溶液制備方法的優(yōu)化結果制備供試液，以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以甲醇溶液作為陰性對照溶液。取上述3種溶液各10 μL，進樣測定并記錄色譜，考察該方法測定歐前胡素含量有無陰性干擾。

2）線性關系。精密稱取歐前胡素對照品8.2 mg，加甲醇定容至25 mL。分別精密吸取0.2、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，各加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的對照品溶液。分別精密吸取上述不同濃度對照品溶液各10 μL進樣測定，以對照品的進樣量（μg）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。

3）精密度試驗。取同一份黃皮根藥材的供試品溶液（2號），連續(xù)進樣測定6次。分別記錄歐前胡素峰面積，計算RSD值。

4）重復性試驗。取黃皮根藥材（2號）粉末，分別精密稱定0.5 g，平行制備6份供試品溶液，進樣測定歐前胡素含量并計算RSD值。

5）穩(wěn)定性試驗。取黃皮根藥材同一供試品溶液（2號），分別于0、2、4、6、12、24 h進樣測定，計算人參皂苷Rb1含量及RSD值。

6）加樣回收率試驗。分別精密稱取已知含量的黃皮根粉末（2號）0.25 g共6份，各加入歐前胡素對照品的甲醇溶液（26.61 μg/mL）15 mL，照供試品溶液制備方法的優(yōu)化結果制備供試品溶液，測定歐前胡素含量，計算平均回收率及RSD值。

7）檢測限及定量限的確定 取歐前胡素對照品甲醇溶液按不同比例進行稀釋，計算信噪比S/N=3、S/N=10時注入儀器的量，分別得歐前胡素對照品的檢出限及定量限。

8）耐用性試驗。分別采用島津C18、賽芬C18和菲羅門Gemini NX C1（8規(guī)格均為5 μm，4.6 mm×250 mm）3根不同品牌色譜柱，測定黃皮根樣品（2號）中歐前胡素的含量及RSD值；分別采用安捷倫1260型和島津LC-20AT 2臺不同品牌的色譜儀，測定黃皮根樣品（2號）中歐前胡素含量，計算RAD值。

1.3.4 樣品含量測定 精密稱取3批黃皮根樣品，制備供試品溶液，按照確定的色譜條件測定黃皮根中歐前胡素的含量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的確定 島津C18、賽芬C18和菲羅門Gemini NX C1（8規(guī)格均為5 μm，4.6 mm×250 mm）3根色譜柱對歐前胡素均可得到良好的分離效果。選擇菲羅門Gemini NX C18柱作為試驗用色譜柱。

2.1.2 流動相的確定 在同一色譜條件下，以甲醇-水（55∶45）為流動相，分離效果優(yōu)于甲醇-水（60∶40）、乙腈-水（55∶45），故以甲醇-水（55∶45）進行試驗。

2.1.3 檢測波長的確定 歐前胡素在圖1所示的幾個波長均有吸收峰，結合黃皮根樣品的高效液相色譜，其在300 nm波長處雜質峰干擾較小，故本研究選用300 nm為檢測波長。

圖1 歐前胡素甲醇溶液紫外光譜

2.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)化結果

2.2.1 單因素試驗結果與分析以不同溶劑及不同提取方式制備黃皮根樣品溶液，測歐前胡素含量，結果見表2。以甲醇、乙醇2種不同溶劑提取的歐前胡素含量相差不大；以超聲提取法和加熱回流提取法提取時，前者歐前胡素含量明顯優(yōu)于后者。本研究確定采用甲醇超聲提取的方法制備供試品溶液。

表2 單因素試驗制備的供試液歐前胡素含量（n=2）

2.2.2 正交試驗結果 正交實驗結果與方差分析見表3、表4。影響提取黃皮根中歐前胡素含量的因素大小順序為：藥材破碎度＞甲醇體積分數(shù)＞提取時間，藥材破碎度對試驗結果影響較大，提取時間對試驗結果影響較小，綜合考慮，確定最佳提取條件為A3B3C1。

表3 正交試驗結果

表4 正交試驗結果方差分析

2.2.3 供試品溶液制備方法的確定綜合單因素試驗及正交試驗結果確定供試品溶液制備方法為：精密稱取黃皮根粉末（過四號篩）0.5 g，置錐形瓶中，精密加入15 mL甲醇并密塞，稱定重量，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）30 min，放至室溫，以甲醇補重，搖勻，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學考察結果

2.3.1 專屬性試驗結果供試品溶液的色譜中均有與歐前胡素對照品保留時間相同的吸收峰，甲醇陰性溶液的色譜則無此吸收峰。說明用該方法測定歐前胡素含量無陰性干擾，專屬性強。結果見圖2。

圖2 對照品（A）、供試品（B）和陰性對照（C）HPLC色譜

2.3.2 標準曲線的繪制歐前胡素進樣量在0.065 6～1.640 0 μg，進樣量與峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為：Y=2 400.3X+3.069 4，r=0.999 8。式中，X為歐前胡素進樣質量，Y為峰面積，標準曲線如圖3所示。

圖3 歐前胡素的標準曲線

2.3.3 精密度試驗結果 連續(xù)測定6次，歐前胡素峰面積分別為1 131.0、1 121.0、1 116.5、1 115.6、1 111.8、1 118.4，平均值為1 119.1，RSD=0.59%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗結果 平行測定6份供試品溶液，歐前胡素含量分別為0.158%、0.157%、0.158%、0.158%、0.157%、0.154%，平均值為0.157%，RSD為0.96%（n=6），表明該試驗方法重復性較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗結果24 h內6次測定供試品溶液，歐前胡素含量分別為0.154%、0.155%、0.155%、0.157%、0.157%、0.155%，平均值為0.156%，RSD為0.87%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗結果 黃皮根樣品溶液的歐前胡素平均回收率為97.2%，RSD為0.89%（n=6）（表5），說明該方法準確度高，可用于測定黃皮根中歐前胡素的含量。

表5 黃皮根中歐前胡素的加樣回收試驗（n=6）

2.3.7 儀器檢出限及定量限的確定測得歐前胡素對照品的檢出限為3.28×10-4μg，定量限為1.1×10-3μg。

2.3.8 耐用性試驗結果3根不同品牌色譜柱測得黃皮根樣品（2號）中歐前胡素的含量分別為0.147%、0.149%、0.145%，平均值為0.147%，RSD為1.36%（n=3）；2臺不同品牌的色譜儀測得黃皮根樣品（2號）中歐前胡素含量分別為0.156%、0.154%，平均值為0.155%，RAD為0.65%（n=2），表明該方法對不同品牌色譜柱和不同品牌高效液相色譜儀具有良好的耐用性。

2.4 樣品含量測定結果

3批黃皮根樣品的歐前胡素含量按干燥品計，分別為0.170%、0.157%、0.044%。

3 討論

色譜條件探索時曾對0.8、1.0和1.2 mL/min 3個不同流速進行比較試驗，結果在上述3種流速下歐前胡素均可得到良好的分離效果，本研究采用的是1.0 mL/min的流速。同時還對25、30、35℃3種柱溫條件進行考察，結果歐前胡素的分離效果均可，柱溫對歐前胡素分離效果影響不大，本研究采用的是25℃。在確定的色譜檢測條件下，測得3批黃皮根的歐前胡素理論板數(shù)均大于3 000，符合高效液相色譜法含量測定標準。

本研究測定了3批不同產(chǎn)地的黃皮根歐前胡素含量，含量差距較大，可能和藥材的生境或采集月份有關，有待采集多批樣品測定進行下一步研究。

本研究基于高效液相色譜法建立黃皮根藥材中的歐前胡素含量測定法，供試品制備方法簡便，色譜分離好，無其他成分干擾，具備較好的專屬性。經(jīng)方法學考察，重復性、精密度好，準確度高，可用于黃皮根質量標準的評價，有利于控制藥材質量，為黃皮根資源的開發(fā)利用和規(guī)范化種植及進一步制定黃皮根藥材質量標準提供了科學依據(jù)。