絞股藍(lán)多糖對(duì)D-半乳糖致衰小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響

劉新勇，黎木蘭，黃嘉琳，王欣雨，唐小川，王曉麗

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005；2.南寧市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，南寧 530001）

腎臟是機(jī)體最為重要的排泄器官，也是毒廢物作用的靶器官，具有排泄水溶性代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)酸堿平衡以及機(jī)體多種生物活性物質(zhì)的分泌等功能。同時(shí)，腎臟也是機(jī)體中最容易受到損傷的器官之一，除了各種疾病導(dǎo)致的腎臟損傷外，還有研究表明，隨著年齡增加或在衰老動(dòng)物模型構(gòu)建中使用致衰劑所致的衰老，可以導(dǎo)致腎臟組織結(jié)構(gòu)、腎功能指數(shù)等發(fā)生變化，導(dǎo)致腎臟功能喪失而直接影響機(jī)體健康［1，2］。因此，防治腎臟病損的研究越來(lái)越受到重視。多糖是目前研究較多的免疫增強(qiáng)劑，其在機(jī)體臟器功能防護(hù)上也有一定的功能。有研究表明多糖可以對(duì)酒精致小鼠腎臟損傷具有良好的保護(hù)作用［3］，能夠改善D-半乳糖致衰小鼠的腎臟結(jié)構(gòu)與腎臟功能［4］。

絞股藍(lán)（Gynostemma pentaphyllum）在中國(guó)分布廣泛，是較有發(fā)展前途的經(jīng)濟(jì)植物和藥物，其成分復(fù)雜，其中主要化學(xué)成分為皂苷、多糖以及黃酮類化合物。以往的研究，人們更多關(guān)注在絞股藍(lán)皂苷類成分上，而對(duì)絞股藍(lán)多糖（Gynostemma pentaphyllumPolysaccharide，GPP）的研究較少。近年來(lái)雖然對(duì)GPP開(kāi)展了一些研究［5，6］，但對(duì)腎臟機(jī)能方面的研究較少，尤其是致衰腎臟方面的研究在國(guó)內(nèi)外還尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，因此本研究以健康昆明系小鼠作為研究對(duì)象，頸背部注射D-半乳糖建立衰老模型，采用石蠟切片、HE染色結(jié)合光學(xué)顯微鏡觀察絞股藍(lán)多糖對(duì)致衰老小鼠腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，從組織形態(tài)學(xué)角度為研究絞股藍(lán)多糖對(duì)致衰老小鼠腎臟的保護(hù)作用以及絞股藍(lán)的開(kāi)發(fā)利用提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康昆明小鼠60只，4周齡，體重（20±1）g，雌雄各半，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（許可證編號(hào)：SYXK桂2014-0001）。飼養(yǎng)于廣西大學(xué)動(dòng)科院一樓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房的標(biāo)準(zhǔn)鼠籠中，讓其自由進(jìn)食、飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為6組：Ⅰ-空白對(duì)照組（生理鹽水組）；Ⅱ-模型組（D-半乳糖致衰老組）；Ⅲ-陽(yáng)性對(duì)照組（Vc組）；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ為絞股藍(lán)多糖（GPP）低、中、高劑量組。

Ⅰ組每天在頸背部皮下注射和腹腔注射生理鹽水，Ⅱ-Ⅵ組各鼠頸背部皮下注射200 mg/（kg·d）D-半乳糖；Ⅱ組腹腔注射生理鹽水；Ⅲ組腹腔注射Vc［200 mg/（kg·d）］；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組分別腹腔注射GPP（低50 mg/（kg·d）、中100 mg/（kg·d）、高200 mg/（kg·d））；共計(jì)42 d。

1.2 石蠟切片制作

將小鼠CO2窒息處死，解剖后，取其腎臟組織置于事先準(zhǔn)備好的波恩氏固定液中48 h以上，做好標(biāo)記。常規(guī)方法制作石蠟切片，切片厚度7 μm；HE染色，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

分別隨機(jī)選擇各組腎臟5張切片，每張切片隨機(jī)選取腎小球10個(gè)，總計(jì)50個(gè)，利用Image J測(cè)量出切片中腎小球直徑和腎小囊寬度后（腎小球直徑為最大直徑，腎小囊寬度分別取最大直徑的兩側(cè)及其尿極一側(cè)中間部位共3處測(cè)量取平均值），利用SPSS 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 HE染色觀察

高倍鏡下，空白對(duì)照組的腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎小球直徑大小正常，腎小囊腔明顯，腎小管排列緊致，結(jié)構(gòu)完整（圖1A）；而D-gal組腎小球明顯萎縮，直徑變小，腎小囊腔變大，腎小體周圍腎小管排列松散，管腔明顯，管壁上皮細(xì)胞界限不清，模糊（圖1B）。注射Vc的陽(yáng)性對(duì)照組和3個(gè)劑量的絞股藍(lán)多糖組均能較明顯地改善腎臟的結(jié)構(gòu)損傷，腎小球形態(tài)正常，周圍的腎小管排列較緊致，結(jié)構(gòu)明顯有所恢復(fù)（圖1C、1D、1E、1F）。結(jié)果表明，絞股藍(lán)多糖可以不同程度地抑制D-gal造成的腎臟組織結(jié)構(gòu)的損傷，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。

圖1 各組小鼠腎臟組織切片（HE染色×40）

2.2 絞股藍(lán)多糖對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腎小球直徑及腎小囊寬度的影響

由表1得知，絞股藍(lán)多糖各濃度組的腎小球直徑均顯著高于D-gal組（P＜0.05），與Vc組相比差異不顯著，與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），各多糖組間腎小球直徑差異均不顯著。結(jié)果表明，D-gal致衰老小鼠的腎臟腎小球直徑明顯變小，使用Vc和絞股藍(lán)多糖均可以使腎小球直徑有所改善，但與空白對(duì)照組相比，絞股藍(lán)多糖的改善效果要好于Vc。

表1 絞股藍(lán)多糖對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠腎小球直徑和腎小囊寬度的影響

絞股藍(lán)多糖50 mg/（kg·d）組和100 mg/（kg·d）組與D-gal組相比，腎小囊寬度減小，差異顯著（P＜0.05），而200 mg/（kg·d）多糖組與D-gal組差異不顯著；50 mg/（kg·d）多糖組和100 mg/（kg·d）多糖組與空白對(duì)照組差異均不顯著，與200 mg/（kg·d）多糖組相比差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，D-gal致衰老小鼠的腎臟腎小囊寬度明顯變大，使用Vc和絞股藍(lán)多糖低、中劑量均可以使腎小囊寬度有所改善，與空白對(duì)照組相近，以上結(jié)果表明絞股藍(lán)多糖對(duì)D-gal致衰老小鼠的腎臟的腎小球直徑和腎小囊寬度有一定的保護(hù)作用。

3 小結(jié)與討論

衰老是一種不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。在自然條件下，隨著年齡的增長(zhǎng)，身體機(jī)能、環(huán)境穩(wěn)定性和應(yīng)激能力都在一定程度上惡化，各種器官的活動(dòng)也在發(fā)生變化，而腎臟的衰老速度又比其他器官還要迅速［7，8］。腎臟的形態(tài)及功能在衰老后會(huì)改變，腎小球?yàn)V過(guò)率降低是腎臟衰老的主要特征［9］，且機(jī)體的衰老會(huì)造成腎臟內(nèi)炎性反應(yīng)的增長(zhǎng)［10，11］，衰老的過(guò)程中往往伴有炎癥穩(wěn)態(tài)失衡，而炎癥又會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步的衰老，炎癥和衰老兩者之間相互影響［12］。

有研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力、減少自由基的產(chǎn)生、減輕炎癥反應(yīng)等方面對(duì)酒精致小鼠腎臟損傷具有良好的保護(hù)作用［3］，還可以改善D-gal致衰老腎臟血液循環(huán)和腎組織形態(tài)，具有延緩腎衰老作用［13］；金福菇多糖可以使D-gal誘導(dǎo)的衰老腎臟中超氧化物歧化酶的活力提高，丙二醛的水平降低，腎臟的病理性變化在一定程度上被修復(fù)，而且腎臟中p53蛋白的表達(dá)量在一定程度上減少［14］；靈芝多糖可以通過(guò)抑制腎臟組織中Zeb1、P16和P21的蛋白水平，上調(diào)抗衰老酶SIRT1的表達(dá)緩解腎臟衰老［15］；菟絲子多糖能使衰老小鼠腎組織中MDA下降，SOD及GSH-PX活力提高達(dá)到抗衰老作用［16］；歸芪多糖可保護(hù)D-半乳糖所致衰老大鼠腎組織的氧化損傷，從而起到保護(hù)腎臟衰老的作用［17］；黃芪多糖聯(lián)合二甲雙胍可對(duì)衰老糖尿病腎臟病變具有保護(hù)作用［18］；山茱萸炮制前后多糖成分對(duì)腎陰虛模型小鼠也均具有一定的抗衰老作用［19］。

本研究也發(fā)現(xiàn)，各GPP組均可以一定程度上改善由D-gal致衰引起的腎小球萎縮，腎小囊腔變大，腎小體周圍腎小管排列松散，管壁上皮細(xì)胞界限不清、模糊等形態(tài)變化。該結(jié)果提示，GPP可以保護(hù)由D-gal致衰引起的腎臟組織結(jié)構(gòu)損傷，從而起到保護(hù)腎臟衰老的作用。綜合來(lái)看，50 mg/（kg·d）多糖組和100 mg/（kg·d）多糖組效果比較明顯，其中以100 mg/（kg·d）多糖組效果最佳。

目前最受關(guān)注的有關(guān)衰老的學(xué)說(shuō)幾乎均認(rèn)為與自由基有關(guān)，而GPP前期研究［5，20，21］表明GPP具有抗氧化、增強(qiáng)免疫的作用，因此推測(cè)GPP可能是通過(guò)免疫促進(jìn)作用和提高抗氧化物質(zhì)的活性，清除氧自由基從而降低自由基對(duì)機(jī)體的氧化損傷，來(lái)實(shí)現(xiàn)保護(hù)致衰腎臟延緩衰老的作用。