環(huán)狀RNAs對糖尿病微血管并發(fā)癥作用的研究進展

龔蕓 周嘉強

糖尿病微血管病變作為糖尿病最常見的并發(fā)癥，嚴重威脅人類的生命健康，是導致糖尿病患者致死、致殘的重要原因之一[1]。研究表明內(nèi)皮受損、氧化應激、代謝異常等多因素參與了糖尿病微血管病變病理機制。然而，其明確的發(fā)病機制至今仍未完全闡明[2]。因此，對于糖尿病微血管并發(fā)癥的研究一直是糖尿病領(lǐng)域關(guān)注的熱點與難點。近年來研究證實，在糖尿病患者和健康受試者外周血中能夠檢測到環(huán)狀RNAs（circular RNAs,circRNAs）存在顯著性差異表達，并且circRNAs可調(diào)節(jié)胰島β細胞功能，影響機體胰島素分泌，說明circRNAs對糖尿病的發(fā)生、發(fā)展起著重要的調(diào)控作用[3]。circRNAs是一類不具有5'末端帽子和3'末端poly（A）尾巴，以共價結(jié)合所形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的一類內(nèi)源性的非編碼RNA分子，在物種間高度保守，具有穩(wěn)定性、多樣性及一定的疾病特異性，可通過轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及翻譯等水平調(diào)控基因的表達，廣泛參與機體的病理生理過程[4-5]。本文旨在通過介紹circRNAs的結(jié)構(gòu)特點、生物學特性，對circRNAs與糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系作一綜述。

1 環(huán)狀RNA概述及其生物學功能

20世紀70年代，科學家首先在RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了circRNAs，但由于其表達水平較低，當時被認為是由于可變剪切出錯形成的，甚至被認為是實驗操作因素或是遺傳異常造成的，沒有引起學術(shù)界的重視[6]。然而，隨著RNA測序技術(shù)的跨越式發(fā)展以及生物信息學手段不斷成熟，在人類、小鼠、線蟲和植物等多細胞生物中發(fā)現(xiàn)成千上萬種circRNAs[7]。circRNAs的形成方式主要有以下2種：（1）通過內(nèi)含子的反義互補序列配對，使3′端剪切供體鄰近5′端剪切受體，從而攻擊受體，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。（2）外顯子反剪接和跳躍剪切后，剪切片段形成內(nèi)部套索結(jié)構(gòu)，誘導其成環(huán)[8]。

盡管circRNAs的表達普遍較低，并且不是真核轉(zhuǎn)錄組中的主要成員，但是由于其特殊的拓撲結(jié)構(gòu)使得circRNAs在某些特殊的時空中發(fā)揮了重要作用，其可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄、微小RNA（miRNA）分子海綿功能、干擾可變剪切、結(jié)合RNA結(jié)合蛋白等方式發(fā)揮豐富的生物學功能[9]。目前在動物研究中所涉及的功能如下：（1）調(diào)控轉(zhuǎn)錄及剪切過程：由于絕大多數(shù)的circRNAs來源于編碼基因的外顯子，這些過程能夠通過競爭外顯子來影響mRNA前體的剪切過程，從而進一步改變基因表達。（2）circRNAs作為內(nèi)源性mRNA的競爭者，是miRNA的海綿吸附體：研究表明circRNAs有很多miRNA的結(jié)合位點，可作為miRNA的海綿吸附體，抑制miRNA的翻譯功能。（3）編碼蛋白質(zhì)：由于缺乏帽子和poly（A）尾巴，circRNAs并不能依賴經(jīng)典的m7G帽子結(jié)構(gòu)途徑進行翻譯。近幾年的研究表明，一小部分circRNAs具有編碼潛能，當內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribo some entry sites，IRESs）元件插入到起始密碼子AUG的上游時，能夠啟動翻譯。除了IRES途徑，N6-甲基腺苷（m6A）修飾能夠直接影響circRNAs翻譯過程。雖然不依賴帽子的翻譯方式效率較低，但circRNAs編碼過程一般都發(fā)生在逆境條件下，可能作為實現(xiàn)某些功能的補充。（4）與RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）相互作用：circRNAs能夠與不同的蛋白質(zhì)相互作用形成特定的circRNA-蛋白質(zhì)復合物，改變相關(guān)蛋白質(zhì)的構(gòu)象從而調(diào)控彼此的功能[10-12]。

2 circRNAs參與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展

隨著糖尿病病程加重，患者會出現(xiàn)多種血管并發(fā)癥，如何有效地阻遏糖尿病患者血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展，是糖尿病研究學界亟待解決的難題。糖尿病血管病變主要包括大血管病變和微血管病變，大血管病變主要累及主動脈、冠狀動脈等大血管，以動脈粥樣硬化為主要特征；微血管病變是糖尿病特有的慢性血管并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜病變、神經(jīng)系統(tǒng)病變、腎臟病變等。在糖尿病微血管并發(fā)癥中，circRNAs發(fā)揮了舉足輕重的作用[13]。

2.1 circRNAs與糖尿病腎病糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病重要的微血管并發(fā)癥，是導致終末期腎病的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，高血糖狀態(tài)下系膜細胞增殖、細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）積累、氧化應激和炎癥的異常調(diào)節(jié)是DN發(fā)生、發(fā)展的重要因素。Hu等[14]通過circ RNAs表達譜芯片分析發(fā)現(xiàn)circRNA_15698在db/db DN小鼠和暴露于高糖（25 mM）的小鼠系膜細胞（SV40-MES13）的表達水平較對照組明顯升高。機制研究發(fā)現(xiàn)circRNA_15698可作為miR-185的“分子海綿”，調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）蛋白的表達，促進了ECM相關(guān)蛋白的合成，從而促進DN的進展。circHIPK3在DN小鼠組織和大鼠系膜細胞中的表達上調(diào)；下調(diào)circHIPK3表達能夠抑制系膜細胞增殖，并顯著降低周期蛋白D1、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、TGF-β1、Ⅰ型膠原（collage I，COL-I）和纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）的表達；同時circHIPK3可以特異性地海綿化miR-185，沉默miR-185可以逆轉(zhuǎn)circHIPK3對上述蛋白的抑制作用，說明circHIPK3可以通過miR-185促進DN的進展[15]。Liu等[16]證實circ_0080425的表達與DN的進展相關(guān)，并對系膜細胞增殖和纖維化產(chǎn)生積極影響。進一步研究表明，circ_0080425充當miR-24-3p的海綿，抑制miR-24-3p表達，影響下游成纖維細胞生長因子11（fibroblast growth factor 11，F(xiàn)GF11）的表達，進而促進腎系膜細胞增殖和纖維化，而FGF11的敲除導致細胞增殖率和纖維化明顯降低，說明circ_0080425與miR-24-3p的競爭性結(jié)合可以從miR-24-3p的抑制中釋放FGF11，從而促進DN的進展。Peng等[17]研究發(fā)現(xiàn)在高糖條件下培養(yǎng)的糖尿病腎臟、系膜細胞和腎小管上皮細胞中circRNA_010383表達水平明顯下調(diào)；過表達circRNA_010383抑制了db/db小鼠的蛋白尿和腎纖維化，提示circRNA_010383可能是未來DN治療的新靶點。上述結(jié)論表明circRNA可能參與DN系膜細胞的增殖和纖維化。Chen等[18]報道上調(diào)的circLRP6通過在高糖條件下海綿化miR-205來調(diào)節(jié)系膜細胞損傷，同時通過海綿化miR-205、上調(diào)高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和激活toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號途徑來調(diào)節(jié)高糖誘導的系膜細胞增殖、氧化應激、ECM積聚和炎癥。此外，有研究報道circAKT3作為miR-296-3p的海綿，通過調(diào)節(jié)miR-296-3p/E-cadherin信號抑制DN系膜細胞外基質(zhì)的積聚，為DN的臨床診斷靶點和治療生物標志物提供了新的潛在機會[19]。這些結(jié)果提示circRNAs可能是DN發(fā)病的關(guān)鍵調(diào)控因子，為進一步了解DN的發(fā)病機制提供了依據(jù)。

2.2 circRNAs與視網(wǎng)膜病變糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常發(fā)生的并發(fā)癥之一，是導致患者視力損害和失明的主要原因。DR主要是由于高血糖條件下視網(wǎng)膜微血管循環(huán)改變，包括內(nèi)皮細胞增殖和通透性增加、異常新生血管和水腫；血糖水平升高會導致氧化應激、炎癥、神經(jīng)元功能障礙、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡和膠質(zhì)細胞激活[20]。Gu等[21]通過環(huán)狀RNA表達譜芯片分析19例DR患者和無DR患者血清中的差異表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30個顯著上調(diào)的circRNAs，提示這些circRNAs參與DR的疾病進展。Wu等[22]通過對DR患者和非DR患者的全血進行高通量全轉(zhuǎn)錄組測序檢測circRNAs的差異表達情況，并通過qRT-PCR對候選circRNAs進行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circ_0001953在區(qū)分DR患者與非DR患者和健康對照者時具有較高的診斷準確性。說明全血circ_0001953可作為DR患者新的診斷標志物和潛在的治療靶點。Zhang等[23]確定了529個在DR和非DR患者之間差異表達的circRNAs，實驗證實circ_0005015在DR患者的血漿、玻璃體樣本以及纖維血管膜中高表達，其作為miR519d3p的海綿吸附體，抑制其活性，引起miR519d3p下游靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）和信號轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表達上調(diào)，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖、遷移和基質(zhì)膠管形成，促進視網(wǎng)膜內(nèi)皮血管生成。circDNMT3B在糖尿病視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs）中表達下調(diào)，且circDNMT3B過表達可減少糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞數(shù)量，減輕視覺損傷。circDNMT3B作為miR-20b-5p海綿，促進BAMBI表達而導致糖尿病視網(wǎng)膜血管功能障礙，提示circDNMT3B可作為DR潛在的治療靶點[24]。circZNF532在糖尿病應激下的周細胞、糖尿病小鼠模型的視網(wǎng)膜血管和糖尿病患者的玻璃體房中的表達上調(diào)，其充當miR-29a-3p海綿并誘導硫酸軟骨素蛋白聚糖4（chondroitin sulfate proteoglycan 4，CSPG4）、賴氨酰氧化酶樣蛋白2（Lysyl oxidase-like 2，LOXL2）和細胞周期蛋白依賴激酶2（Cyclin-dependent kinase 2，CDK2）的表達，從而改善糖尿病玻璃體誘導的視網(wǎng)膜周細胞變性和血管功能障礙[25]。葛慧敏等[26]發(fā)現(xiàn)circPWWP2A通過海綿樣吸附miRNA-579以發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）的作用，導致下游靶基因Angiopoietin 1/Occludin/SIRT1表達的增加，從而參與調(diào)控周細胞功能及周細胞與內(nèi)皮細胞間的串擾，進而加重了糖尿病性視網(wǎng)膜微血管病變的過程。說明誘導circZNF532和circPWWP2A可成為一種新的DR治療方法。細胞凋亡、炎癥和氧化應激是DR進展的標志。結(jié)果發(fā)現(xiàn)circRNA_0084043的缺失顯著提高了內(nèi)皮細胞存活率，抑制了高糖誘導的細胞凋亡，降低氧化應激活性，有效抑制高糖刺激的炎癥反應；同時研究發(fā)現(xiàn)circRNA_0084043能夠通過海綿化miR-140-3p和誘導視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化生長因子α（transforming growth factorα，TGFA）表達參與DR的進展[27]。circHIPK3在糖尿病視網(wǎng)膜中的表達顯著上調(diào)，并作為內(nèi)源性miR-30a-3p海綿，導致血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）和無翅基因相關(guān)整合位點2（Wnt2）表達增加，從而導致炎癥和血管功能障礙[28]。另有研究報道circZNF609在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜血管細胞及高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中表達明顯上調(diào)，circZNF 609可充當內(nèi)源性miR-615-5p海綿并抑制其表達，導致肌細胞增強因子2基因（myocyte specific-enhancer factor 2，MEF2A）表達增加，促進病理性血管生成和內(nèi)皮細胞氧化應激損傷，從而促進DR進展[29]。目前大多數(shù)學者的研究均集中在circRNAs通過ceRNA機制，調(diào)控其下游靶基因的表達進而參與DR進展。circRNAs在DR發(fā)生、發(fā)展中的其他分子機制有待更深入的研究。

2.3 circRNAs與糖尿病周圍神經(jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）DPN是糖尿病最常見、最棘手的并發(fā)癥，約1/3的糖尿病患者患有DPN，給糖尿病治療帶來巨大的經(jīng)濟負擔[30]。目前有關(guān)circRNAs在周圍神經(jīng)病變研究較少。Zhang等[31]通過對野生型和糖尿病小鼠進行高通量測序鑒定差異表達circRNAs，結(jié)果共鑒定出15個差異表達的circRNAs以及133個差異表達的mRNAs，提示circRNAs可能參與了DPN mRNA表達的調(diào)控。外源性沉默circRNA ACR可以降低miR-145-3p的表達，激活PI3K/AKT/mTOR信號通路來減輕高糖引起的大鼠雪旺細胞系細胞RSC96的細胞凋亡、自噬和以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成[32]。糖尿病神經(jīng)痛是晚期神經(jīng)病變，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。Wang等[33]研究發(fā)現(xiàn)circHIPK3在患有神經(jīng)源性疼痛的糖尿病患者血清和鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導的糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)中高表達，且circHIPK3表達上調(diào)與2型糖尿病患者的神經(jīng)源性疼痛程度呈正相關(guān)。circHIPK3在STZ誘導糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)表達水平及疼痛評分明顯增加，而沉默circHIPK3可降低疼痛評分，減少DPN所致的神經(jīng)型疼痛。研究發(fā)現(xiàn)慢性坐骨神經(jīng)壓迫損傷大鼠模型（chronic compression injury，CCI）中circ_0005075明顯增加，下調(diào)circ_0005075表達能夠誘導miR-151a-3p表達下調(diào)和阻斷NOTCH2，從而導致靶向環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、白介素6（interleukin 6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的下調(diào)來抑制神經(jīng)炎癥，緩解神經(jīng)源性疼痛[34]。此外，Wei等[35]類似的研究發(fā)現(xiàn)在CCI大鼠模型中circZRANB1表達下調(diào)，其通過海綿狀吸附miR-24-3p，調(diào)控LPAR3表達，介導Wnt5a/β-Catenin信號通路促進神經(jīng)病理性疼痛。上述這些研究結(jié)果說明circRNAs在DPN及其神經(jīng)病理性疼痛中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其具體的相關(guān)機制有待進一步的探究。

3 展望

近年來，隨著高通量技術(shù)和生物信息學的快速發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)許多circRNAs在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的角色，深入探究circRNAs在糖尿病及其微血管并發(fā)癥中的作用及具體分子機制，將有希望為糖尿病微血管并發(fā)癥的防治工作提供參考和理論依據(jù)。然而，既往大多數(shù)研究均集中在circRNAs通過競爭性內(nèi)源RNA機制參與糖尿病血管并發(fā)癥疾病進展，并且關(guān)于circRNAs生物學功能尚處在研究階段。因此，需要進一步探索并揭示circRNAs在糖尿病微血管并發(fā)癥的確切機制，circRNAs能否成為糖尿病微血管并發(fā)癥診斷、治療和預后的標志物，仍是未來需要不斷探索的問題。