高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用

劉佳音，安洋，蘇俊，杜光光，王佳，董慶海，劉繼華

(吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

對(duì)于大分子蛋白質(zhì)及多肽的分析研究是目前生命研究中重要的課題之一，蛋白質(zhì)的復(fù)雜性以及結(jié)構(gòu)的多樣性對(duì)于表現(xiàn)不同的食品功能和藥品特性來(lái)說(shuō)十分重要：其功能特性和結(jié)構(gòu)的變化對(duì)食品質(zhì)量影響很大，在食物的成分檢測(cè)與鑒定中也起著重要的作用；蛋白質(zhì)藥物目前在生物技術(shù)藥物中發(fā)展得十分迅猛,已經(jīng)成為醫(yī)藥產(chǎn)品中的重要組成部分，主要包括生長(zhǎng)因子、單克隆抗體、重組抗體等，具有較高的活性和特異性，毒性很低，針對(duì)蛋白質(zhì)藥物的研究對(duì)于人類(lèi)的健康與社會(huì)的發(fā)展都具有著重大的意義[1]。

在大分子的各項(xiàng)分析中，質(zhì)譜技術(shù)有著快速、超微量、高靈敏度、高特異性等許多優(yōu)點(diǎn)。由于實(shí)驗(yàn)要求的不同，高效液相色譜儀可以和不同的質(zhì)譜、檢測(cè)器聯(lián)用，高分辨質(zhì)譜等在定性方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)，可以用于組學(xué)研究初期的全譜掃描分析；高靈敏質(zhì)譜在定量方面優(yōu)勢(shì)明顯，可以很好地解決精確測(cè)量蛋白質(zhì)等生物大分子的分子量和掌握分子結(jié)構(gòu)的信息等問(wèn)題。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)在醫(yī)藥、食品、生物等各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用有著重要的地位，滿(mǎn)足了現(xiàn)代各類(lèi)物質(zhì)分析中高通量和高精度的要求，且已經(jīng)成為大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中蛋白質(zhì)組學(xué)研究的首選生物分析工具，本文綜述了高效液相色譜-質(zhì)譜在蛋白組學(xué)中的應(yīng)用以及在蛋白質(zhì)的鑒定分析與含量測(cè)定中的應(yīng)用。

1 蛋白組學(xué)研究及定性鑒別

蛋白組學(xué)本質(zhì)上就是大規(guī)模水平的研究蛋白質(zhì)的特征，通過(guò)蛋白組學(xué)可以獲得在蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過(guò)程的認(rèn)知以及對(duì)生命的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和活動(dòng)進(jìn)行解釋?zhuān)彩嵌喾N疾病機(jī)理闡述的重要途徑。蛋白組學(xué)有大概3種研究策略，其中自底向上的方法又被稱(chēng)為鳥(niǎo)槍蛋白組學(xué)方法，將變性的蛋白質(zhì)用蛋白酶酶解，在特定位點(diǎn)將多肽鏈降解為小肽段，由于得到的肽段具有很好的穩(wěn)定性和特異性，能夠快速鑒別復(fù)雜樣品中的組分，因此成了大規(guī)模研究蛋白質(zhì)的首選技術(shù)之一。

在以前對(duì)蛋白質(zhì)的鑒定中，主要采用的是從頭測(cè)序的傳統(tǒng)方法和雙向電泳來(lái)完成，隨著序列數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)模的增長(zhǎng)，利用質(zhì)譜將樣品分子離子化，根據(jù)分子離子間荷質(zhì)比的不同來(lái)分離并生成圖譜，可以快速、高效地對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定分析，且使用的樣品量小。Sha等[2]用HPLC-LTQ/Orbitrap高分辨率質(zhì)譜技術(shù)準(zhǔn)確地區(qū)分牛皮明膠，豬皮明膠和驢皮明膠，僅在驢皮中檢測(cè)到血紅蛋白，并分別發(fā)現(xiàn)了牛明膠、豬明膠和驢明膠的49、50和55個(gè)理論獨(dú)特序列片段，在單個(gè)明膠中檢測(cè)到28、27和14個(gè)唯一峰分別代表牛的明膠，豬的明膠和驢的明膠，在混合物中，可檢測(cè)的標(biāo)記肽很容易識(shí)別，而沒(méi)有強(qiáng)烈的峰干擾。潘曉東等[3]基于自下而上的蛋白分析策略，用Tris-HCl提取蝦中的蛋白后用胰蛋白酶水解，采用超高效液相色譜儀Vanquish LC分離后用Q-Exactive四極桿靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜測(cè)定，通過(guò)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件搜索鑒別過(guò)敏蛋白，得到了4種典型的肽段，原肌球蛋白、精氨酸激酶、血藍(lán)蛋白和肌漿鈣結(jié)合蛋白，它們的肽段覆蓋率分別為53%、36%、12%和12%，并且氨基酸的翻譯后修飾沒(méi)有明顯的規(guī)律，主要修飾位點(diǎn)為天冬氨酸的甲基化、天冬酰胺和谷氨酰胺的脫酰胺化以及蛋氨酸的氧化。

房芳等[4]用Nano-HPLC-Q-TOF-MS結(jié)合鳥(niǎo)槍蛋白組學(xué)的方法比對(duì)蛋白酶解后的特征肽段序列，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)并導(dǎo)入Protein Pilot 5.0軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定，找到了4條驢、牛和豬特征肽段和兩條馬特征肽段，采用MRM方法對(duì)3種膠原蛋白的理論特征肽進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)了4條理論特征肽的存在，解決了在肽段層面上鑒別阿膠中異源性物種的問(wèn)題。Bargen等[5]用AB SCIEX TripleTOF 5600系統(tǒng)與Eksigent nanoLC偶聯(lián)，Orbitrap系統(tǒng)與Accela HPLC系統(tǒng)連接，分別在色譜柱上進(jìn)行分離，通過(guò)使用肌纖維蛋白和肌漿蛋白質(zhì)提取物的胰蛋白酶消化的鳥(niǎo)槍蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定特異性的生物標(biāo)志物肽，在Orbitrap上鑒定出了約400種蛋白質(zhì)中的約4 000～4 500個(gè)肽，而在TOF儀器上針對(duì)相同樣品鑒定了約500種蛋白質(zhì)中的約5 500種肽；并且開(kāi)發(fā)了一種MRM3方法檢測(cè)牛肉基質(zhì)中最敏感的生物標(biāo)記物肽的污染的LOD約為0.55%，該方法顯示出的靈敏度與最敏感的PCR和ELISA相當(dāng)。李瑩瑩等[6]將樣品用胰蛋白酶消化后用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用高分辨系統(tǒng)對(duì)種屬特征肽進(jìn)行篩選，鑒定到各個(gè)物種相對(duì)于其他物種專(zhuān)屬性的多肽條數(shù)，篩選出目標(biāo)肽段，再使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜SRM模式，進(jìn)行多肽的定性及定量分析，最終選擇了羊肉多肽8 條，鴨肉多肽10條作為定性離子的母離子，得到總離子流圖，該方法體系檢出限為0.5%鴨肉定性判別，定量限為1%鴨肉摻假判別，基本實(shí)現(xiàn)了羊肉中摻假鴨肉的量化鑒別。

2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用

傳統(tǒng)的物種鑒別大多都是在蛋白水平上進(jìn)行檢測(cè)的，通常包括4個(gè)步驟：蛋白質(zhì)的分離、消化，所得肽段的質(zhì)譜分析以及將觀察到的肽段與數(shù)據(jù)庫(kù)中的肽段進(jìn)行比較。在鑒定蛋白質(zhì)的大部分實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)譜是一種能夠檢測(cè)分子量、碳骨架與結(jié)構(gòu)信息的技術(shù)手段，與高效液相色譜法結(jié)合起來(lái)被視為是分析復(fù)雜蛋白質(zhì)和肽段必不可少的工具，構(gòu)成了蛋白質(zhì)鑒定分析的一套高效流程。在定性鑒定中，HPLC-MS技術(shù)可以進(jìn)行多種分析，蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列和對(duì)翻譯后修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定等。

2.1 對(duì)翻譯后修飾的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定 蛋白質(zhì)的翻譯后修飾可以在蛋白質(zhì)的特定氨基酸位點(diǎn)上引入不同的基團(tuán)，比如磷酸化、糖基化、乙酰化、甲基化等，這是調(diào)控蛋白質(zhì)功能的重要方式[7]，隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定和表征。

碘乙酰胺(IAA)可以進(jìn)行蛋白質(zhì)的烷基化修飾，使得蛋白質(zhì)的酶切高效進(jìn)行，王繼峰等[8]用牛血清白蛋白(BSA)作為研究對(duì)象,比較適量和過(guò)量的IAA對(duì)酶切結(jié)果的影響，用Agilent 1100毛細(xì)管液相色譜系統(tǒng)，梯度洗脫出的組分經(jīng)ESI離子源進(jìn)入LTQ-FT質(zhì)譜進(jìn)行定性分析，一級(jí)全掃描在FT-ICR中進(jìn)行，得到的最強(qiáng)的10個(gè)離子進(jìn)入離子阱進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，用Maxquant軟件進(jìn)行鑒定，最終得到半胱氨酸的烷基化比例最大，其次容易發(fā)生烷基化的是肽段N端氨基酸，為46%；一共鑒定到46條多烷基化肽段，并且表明了過(guò)量的烷基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)的定性與定量分析都可能會(huì)產(chǎn)生較大影響。Bl?chl等[9]用HPLC-MS研究了小鼠的單克隆免疫球蛋白，確定了小鼠IgG中的SpeB切割位點(diǎn)，用離子對(duì)反相HPLC聯(lián)用高分辨率質(zhì)譜分析得到的不同亞類(lèi)特征的FC/2部分和N-糖基化變體，它們二者均可以影響IgG效應(yīng)子功能。Geng等[10]將雞蛋清蛋白用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化后，用高性能液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法分析其糖基化結(jié)構(gòu)，用MASCOT處理后從MS/MS數(shù)據(jù)獲得N-糖苷，共鑒定出了88種獨(dú)特的糖肽，這些肽含有71個(gè)N-糖苷類(lèi)，屬于26個(gè)蛋白，在26個(gè)已鑒定的蛋清N-糖蛋白中，約46%攜帶一個(gè)N-糖鏈，其中卵黏蛋白N-糖基化最嚴(yán)重，其次為卵糖蛋白。Kisrieva等[11]用HPLC-MS/MS技術(shù)與無(wú)標(biāo)記比較蛋白質(zhì)組分析方法，研究了腦缺血(CI)患者和健康人血漿樣品中蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTM)之間的相對(duì)差異，并在Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)中使用了多個(gè)MS/MS搜索查找，最終在CI血漿樣品中觀察到有PTM的肽比例有所增加包括絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化，賴(lài)氨酸的乙酰化和蛋白N末端，賴(lài)氨酸的泛素化以及谷氨酰胺脫酰胺。

2.2 蛋白質(zhì)氨基酸序列的測(cè)定 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)也就是蛋白質(zhì)的氨基酸序列，也包括二硫鍵的位置上，是蛋白質(zhì)生物功能的基礎(chǔ)。通過(guò)HPLC-MS技術(shù)可以得到許多的肽段信息，在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，可以準(zhǔn)確地鑒定多肽和蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)。Shen等[12]將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白超聲處理酶促水解后經(jīng)陽(yáng)離子交換色譜分離，收集到4個(gè)餾分，再進(jìn)一步用Waters 600 HPLC反相色譜進(jìn)一步分離前兩個(gè)活性最高的餾分，用LC-Q-TOF-MS對(duì)其中來(lái)源于卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的14種肽進(jìn)行了表征鑒定，對(duì)已鑒定的肽從頭測(cè)序并且研究了它的抗氧化性能，并得出最有效的、ORAC值最高的肽序列是WNIP。張萍等[13]在對(duì)冬蟲(chóng)夏草及相關(guān)的發(fā)酵蟲(chóng)草類(lèi)樣品的特征肽段進(jìn)行序列鑒定，聯(lián)用了EASY-nLC1000超高效液相色譜儀與四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱-線性離子阱三合一組合式 Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀對(duì)真菌蛋白的酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，建立了6種樣品的酶解質(zhì)譜肽圖，尋找各樣品的特征肽段，一級(jí)質(zhì)譜采用Orbitrap檢測(cè)器，二級(jí)質(zhì)譜采用離子肼檢測(cè)器，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)特征肽段進(jìn)行序列鑒定，鑒定出了冬蟲(chóng)夏草2個(gè)特征肽段及序列，發(fā)酵冬蟲(chóng)夏草菌絲體3個(gè)特征肽段及序列等。Cheng等[14]用ESI+電離模式的超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF-MS)方法鑒定胰蛋白酶消化后的五種明膠得到5種離子峰強(qiáng)度色譜圖，將3D LC/MS數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為精確質(zhì)量保留時(shí)間的2D矩陣之后進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的主成分分析，可以檢查出明膠之間的異常值和分類(lèi)趨勢(shì)，識(shí)別出重要的標(biāo)記肽，通過(guò)在數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得各來(lái)源的蛋白質(zhì)的序列，使用Biopharmalynx 1.2鑒定了每個(gè)明膠標(biāo)記肽。

2.3 相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量在蛋白質(zhì)的分析中是一個(gè)很重要的參數(shù)，目前比較常用的有MALDI-TOF-MS，結(jié)合了MALDI離子化技術(shù)和TOF質(zhì)譜技術(shù)，可以直接對(duì)分子量進(jìn)行測(cè)定，效率很高且對(duì)極微量的樣品液可以分析；另一種是ESI-MS，結(jié)合了電噴霧電離ESI和質(zhì)譜技術(shù)，可以得到多電荷峰，獲得精確的分子量數(shù)值。這兩種方法各有其優(yōu)點(diǎn)及適用的領(lǐng)域。MALDI離子化效率非常高，可以對(duì)極微量的樣品進(jìn)行分析。桂萌[15]對(duì)鱘魚(yú)特定腐敗菌產(chǎn)生的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類(lèi)(AHLs)提取物用HPLC-Trap-Ms進(jìn)行三級(jí)碎片結(jié)構(gòu)分析，由于丟失高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)，可以通過(guò)特征碎片鑒定出兩種AHLs化合物;用HPLC/QqQ-Ms鑒定得出了除上面兩種之外的第三種；用HPLC-QTOF-Ms和串聯(lián)全信息數(shù)據(jù)掃描功能，可以得到母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，所測(cè)得的各峰精確分子量和計(jì)算得到的理論值均小于5 mDa，共鑒定出4種AHLs：C6-HSL、3-oxo-C8-HSL、3-OH-C8-HSL和C8-HSL。樂(lè)復(fù)能是一種相對(duì)分子質(zhì)量為19300的基因工程類(lèi)藥物，李萌等[16]用HPLC-ESI-Q-TOF-MS繪制樂(lè)復(fù)能經(jīng)胰蛋白酶酶切后的液質(zhì)肽圖,并定位二硫鍵；用電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ESI-Q-TOF-MS)測(cè)定其精確相對(duì)分子質(zhì)量，找到了12個(gè)酶切肽段，檢測(cè)到的相對(duì)分子質(zhì)量為19 311.63，將肽圖與相對(duì)分子質(zhì)量結(jié)合分析,推測(cè)氨基酸序列是正確的。Wang等[17]將芝麻蛋白水解物用3種蛋白酶水解，再用固定的金屬親和色譜法從胰蛋白酶水解產(chǎn)物中分離出金屬螯合肽并用反相(RP)-HPLC和質(zhì)譜(LC-MS/MS)鑒定出6種鋅螯合肽，分別得到了它們的分子量，與理論值相符。Mojica等[18]將13種豆類(lèi)蛋白分離物用SDS-PAGE和蛋白質(zhì)凝膠內(nèi)消化HPLC/MS識(shí)別，主要有菜豆素、凝集素、蛋白酶和α-淀粉酶抑制劑；用HPLC-MS/MS鑒定出豐富的肽，分子質(zhì)量范圍為300～1 500 Da，重要的序列為 SGAM、DSSG、LLAH、YVAT、EPTE和KPKL。α-淀粉酶抑制劑被鑒定為條帶J/K/L，分子量分別為18、16和14 kDa。凝集素(F帶和H帶)分別為33和25 kDa，胰蛋白酶抑制劑在20 kDa(I帶)，BBI在10 kDa以下(M帶)。

3 定量測(cè)定中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)的定量分析是在蛋白質(zhì)水平上通過(guò)比較樣品中目標(biāo)蛋白的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)完成的，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作，在生物制品、食品、藥品的質(zhì)量監(jiān)測(cè)中扮演著重要的角色，它可以用來(lái)確定樣品中蛋白質(zhì)的總量，也可以測(cè)某種單一蛋白成分的含量，是尋找治療靶標(biāo)分子和疾病標(biāo)志物的有效工具。

3.1 定量蛋白組學(xué)研究 細(xì)胞蛋白的表達(dá)范圍很廣，定量所需的信息質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)量，因此目前的質(zhì)譜技術(shù)通常僅對(duì)樣品中蛋白的一部分進(jìn)行采樣，在鑒定出的蛋白質(zhì)中只有一小部分可以可靠地定量，通常需要在實(shí)驗(yàn)之間比較每種單獨(dú)的肽。Bhat等[19]將乳清中的蛋白質(zhì)分離成高豐度和低豐度用胰蛋白酶消化后在C18超高效液相色譜色譜柱上分離肽，用基于高分辨率Q-TOF質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的來(lái)區(qū)分比較澤西和克什米爾牛的牛奶蛋白質(zhì)組水平，使用搜索引擎尋找肽段光譜進(jìn)行鑒定，得到克什米爾和澤西島牛之間180種蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，共有81種高豐度和99種低豐度蛋白質(zhì)表達(dá)，通過(guò)通路分析進(jìn)行生物學(xué)解釋?zhuān)瑄nique和razor peptides進(jìn)行定量，結(jié)果得到克什米爾人的牛乳中表達(dá)最上調(diào)的為免疫相關(guān)蛋白和藥物代謝酶；澤西牛奶蛋白質(zhì)組則呈現(xiàn)更高濃度的酶調(diào)節(jié)劑和水解酶表達(dá)。

目前常用的有兩種定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，一種是使用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)，另一種涉及液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)和穩(wěn)定同位素標(biāo)記。由于凝膠電泳法與常用的染色程序結(jié)合使用時(shí)，對(duì)于蛋白質(zhì)檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍有限，而液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜的方法有著很寬的動(dòng)態(tài)范圍，能夠檢測(cè)到幾乎所有的蛋白質(zhì)，因此可以運(yùn)用質(zhì)譜儀識(shí)別標(biāo)記的和未標(biāo)記形式的肽之間的質(zhì)量差異，比較它們各自的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)定量。Mori等[20]將牛血清蛋白用胰蛋白酶消化后用18O單標(biāo)記方法標(biāo)記肽片段的C末端羧基，使用配備了NanoFrontier LD的納米級(jí)液相色譜電噴霧電離質(zhì)譜(nano LC-ESI-MS)來(lái)分析18O標(biāo)記肽，用nano LC-ESI-MS/MS分析未標(biāo)記肽與標(biāo)記肽的任意比例混合物，結(jié)果證明單標(biāo)記需要較高的PH條件，加入MEA有助于產(chǎn)生18O單標(biāo)記,在產(chǎn)物離子中使用y離子的同位素比能提供豐富的豐度比，觀察到的5個(gè)肽片段的同位素比在理論值的2倍以?xún)?nèi)；還通過(guò)分析溶菌酶的豐度比將18O單標(biāo)記與iTRAQ方法比較，在此實(shí)驗(yàn)中，18O單標(biāo)記得到的值更接近，表明了目前的方法對(duì)結(jié)合nano LC-ESI-MS/MS的定量蛋白質(zhì)組學(xué)是有效的。

Yang等[21]采用體外標(biāo)記相對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)，用不同的標(biāo)記試劑標(biāo)記牛、水牛、山羊和駱駝奶中的乳清蛋白質(zhì)，利用強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜和反相nano色譜分離后通過(guò)使用串聯(lián)質(zhì)譜MS/MS測(cè)量報(bào)告離子的峰強(qiáng)度，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定出211種，計(jì)算標(biāo)記樣品中鑒定出的肽段的相對(duì)比例進(jìn)行肽定量，并且通過(guò)基因本體論對(duì)113種蛋白進(jìn)行功能表征將其分成3個(gè)功能組，根據(jù)PCA結(jié)果得出的動(dòng)物物種間的差異蛋白177種，鑒定比較后可以得出乳清蛋白中的主要成分α-乳清蛋白在駱駝奶中豐度最高，牛乳、山羊乳中不存在，表征了不同物種中蛋白質(zhì)組模式的差異。iTRAQ技術(shù)相對(duì)于其他的蛋白質(zhì)組學(xué)定性定量技術(shù)來(lái)說(shuō)，重復(fù)性好，適用于低豐度蛋白的研究。馮培民等[22]利用同位素標(biāo)記的相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ-4plex)與液相色譜和質(zhì)譜串聯(lián)結(jié)合的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析技術(shù)，對(duì)慢性乙肝證候差異蛋白組學(xué)進(jìn)行對(duì)比研究，鑒定出蛋白質(zhì)501個(gè)，其中可以用來(lái)定量的有491種，比較了肝郁脾虛證與脾胃濕熱證、肝膽濕熱證和健康人組之間上調(diào)蛋白和下調(diào)蛋白的數(shù)量，從蛋白的功能分析來(lái)看，各組間均有差異蛋白的不同功能特點(diǎn)，各組間均有差別的通路。Affolter等[23]用3種策略對(duì)富含乳脂小球膜(MFGM)的兩種濃縮物的蛋白質(zhì)組進(jìn)行定性定量分析，將強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜與反相C18分離相結(jié)合并配備了nano ESI來(lái)源的Orbitrap MS系統(tǒng)用2D-2L方法實(shí)現(xiàn)了鳥(niǎo)槍蛋白組學(xué)分析，其次將消化液用高效液相色譜分離然后重新注入Orbitrap MS系統(tǒng)進(jìn)行無(wú)標(biāo)記的半定量分析,最后通過(guò)穩(wěn)定的同位素稀釋MS與在三重四極桿MS系統(tǒng)上的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)了對(duì)所選7種蛋白的絕對(duì)的定量分析，分別揭示了WPC中的244種蛋白質(zhì)和BMP中的133種蛋白質(zhì)身份，對(duì)前34種蛋白進(jìn)行指紋分析與相對(duì)定量，產(chǎn)生了有價(jià)值的蛋白質(zhì)指紋圖譜，并提供了這兩個(gè)餾分中蛋白質(zhì)含量的廣泛表征。

3.2 其他定量研究 除了用蛋白組學(xué)方法，也有許多對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行絕對(duì)定量和相對(duì)定量的研究。RAD是一種基于還原胺化和二甲基化的蛋白質(zhì)糖基化定量方法，即先用NaBH3CN或NaBD3CN還原樣品使產(chǎn)生1 Da的質(zhì)量偏移并穩(wěn)定早期蛋白質(zhì)糖基化，Tong等[24]將樣品用胰蛋白酶消化后用二甲基化試劑還原胺化，RAD標(biāo)記后的樣品用MALDI-TOF-TOF-MS進(jìn)行分析，根據(jù)糖基化肽和非糖基化肽的質(zhì)量變化，識(shí)別出同位素峰，在蛋白質(zhì)和肽水平上都實(shí)現(xiàn)了定量，得到了R(L/H)低于1的39個(gè)肽段和高于上述3個(gè)肽段的3個(gè)肽段。Casado-Vela等[25]描述了兩種樣品4-protmix和8-protmix適用于使用iTRAQ進(jìn)行相對(duì)蛋白質(zhì)定量，ChipLC與6530 Q-TOF聯(lián)用和1200 nano-HPLC-LTQ Orbitrap聯(lián)用對(duì)3個(gè)復(fù)制品進(jìn)行分析，成功鑒定和定量了樣品中的所有蛋白質(zhì)，使用4-protmix，可以測(cè)量高達(dá)24倍的相對(duì)蛋白質(zhì)變化；8-protmix可以定量蛋白質(zhì)混合物中相對(duì)蛋白質(zhì)變化的濃度，濃度范圍為兩個(gè)數(shù)量級(jí)，相對(duì)豐度差異十倍。Alexia等[26]用胰蛋白酶消化人肝和腸道微粒體后獲得肽，并通過(guò)高效液相色譜和加熱的電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜使用兩個(gè)蛋白型肽對(duì)14種主要的CYP450亞型進(jìn)行絕對(duì)蛋白質(zhì)定量，對(duì)于所有蛋白型肽，在適當(dāng)?shù)男?zhǔn)范圍內(nèi)是線性，LLOQ濃度為0.1 nmol·L-1，確定此方法是可行的并用于分析了市售人肝微粒體中的12種CYP450，檢測(cè)到的CYP4F2為(20±1)pmol·mg-1；CYP3A7為(2.3±1.5)pmol·mg-1；CYP2J2為(2.1±0.6)pmol·mg-1。

本篇綜述探討了HPLC-MS在大分子蛋白質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用，主要介紹了鑒定與定量中的一些內(nèi)容，由于篇幅有限，還有許多定性鑒定的方法以及多種類(lèi)型藥物的定量問(wèn)題并沒(méi)有詳細(xì)介紹。蛋白組學(xué)在一定程度上推動(dòng)了液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，這項(xiàng)技術(shù)也同時(shí)推動(dòng)著生物大分子領(lǐng)域的研究。不同種類(lèi)的質(zhì)譜儀有著各自的特點(diǎn)，分析不同的物質(zhì)時(shí)可以選擇不同的方法以達(dá)到最好的分析效果，但也存在著一些困難，有些對(duì)于低含量的物質(zhì)的檢測(cè)的準(zhǔn)確性要較差一些。綜上所述，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)不僅在各種小分子化合物的檢測(cè)中發(fā)揮著重要的作用，以后將會(huì)在大分子物質(zhì)的分析中發(fā)揮著更重要的作用，在摻假物質(zhì)鑒別、靶蛋白表征和生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)等中起到重要的作用[27]。隨著時(shí)代的發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將會(huì)為分析科學(xué)的發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。