基于生物合成氣囊的影像造影劑的研究進(jìn)展

黃 馳 張 月 辛 瑩 劉治軍

具有多種影像學(xué)對比顯影能力的多模態(tài)影像造影劑已成為當(dāng)前影像學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。多模態(tài)影像造影劑多是在其組成成分中加入聲響應(yīng)、磁性或光敏物質(zhì)等以實(shí)現(xiàn)多模態(tài)響應(yīng)，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，制備相對繁瑣。氣囊是一類在浮游生物或古菌體內(nèi)由基因編碼合成的中空雙錐形、剛性、多孔蛋白質(zhì)納米結(jié)構(gòu)，長約100～600 nm，寬約45～250 nm，囊壁厚約2 nm，其對水不通透，但允許氣體自由通過，因此氣囊內(nèi)外幾乎無氣壓差，可在納米級尺寸保持穩(wěn)定的物理狀態(tài)［1］。氣囊的這一特殊性質(zhì)，使其具有同時(shí)作為超聲、MRI、光學(xué)相干斷層掃描（OCT）等多種模式造影劑的潛力。氣囊主要由8～14個(gè)不同的基因編碼，包括2個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白即氣囊蛋白A（GvpA）和氣囊蛋白C（GvpC），以及幾個(gè)次要蛋白和調(diào)節(jié)蛋白組成。GvpA是氣囊蛋白質(zhì)外殼的主體，GvpC附著在GvpA外層，影響氣囊整體的完整性和結(jié)構(gòu)強(qiáng)度。不同物種來源的氣囊由于其蛋白組成不同，還具有不同的壓力敏感性，在達(dá)到某一特定臨界壓力時(shí)會(huì)破裂，因此可以利用其這一特征進(jìn)行氣囊破裂前后的圖像減影，獲得來自某一種氣囊的特異性信號［1-2］。此外還可以通過基因編輯等方式對氣囊的組成蛋白進(jìn)行修飾和改性，從而獲得具有不同抗壓性、靶向性等特性的氣囊［3-4］。研制基于氣囊的多功能造影劑及聲學(xué)報(bào)告基因是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本文就基于氣囊的影像造影劑的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、基于氣囊的超聲造影劑

超聲造影劑通過改變局部組織的聲學(xué)特性，如背向散射系數(shù)、衰減系數(shù)、非線性效應(yīng)等，從而提高超聲成像的分辨力、對比度和準(zhǔn)確性。Shapiro等［2］首次報(bào)道從水華魚腥藻（Ana）和嗜鹽古菌（Halo）分離提純的氣囊在超聲輻照下能產(chǎn)生穩(wěn)定、強(qiáng)烈的背向散射信號，可用于超聲造影；且Halo氣囊能產(chǎn)生強(qiáng)烈的二次諧波和三次諧波信號。二次諧波信號是由造影劑微泡在聲場中的非線性運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的，其峰值頻率是基波的2倍。通過寬頻超聲探頭接收發(fā)射頻率的2倍頻率實(shí)現(xiàn)由二次諧波組成的影像，而組織解剖結(jié)構(gòu)的基波信號基本不被接收，從而凸顯來自微泡造影劑的信號，獲得顯著的造影效果。Yang等［5］研究也證明，氣囊具有足夠的回聲特性，且回聲強(qiáng)度與氣囊濃度呈正相關(guān)，可作為超聲造影劑的理想材料；并且Ana氣囊在聲場中也能產(chǎn)生顯著的二次諧波，降低組織背景信號和改善圖像質(zhì)量；而Shapiro等［2］未檢測到Ana氣囊的諧波信號是因?yàn)锳na氣囊需在更高頻率的聲場中才能產(chǎn)生二次諧波信號，而這一頻率超過了該實(shí)驗(yàn)中所用的頻率及探頭的接收頻率。Cherin等［6］通過有限元模擬及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氣囊在靜水中的臨界破壞壓力低于在超聲脈沖中的臨界破壞壓力，當(dāng)氣囊處于兩個(gè)臨界壓力之間的超聲脈沖壓時(shí)，能產(chǎn)生穩(wěn)定、強(qiáng)烈的二次諧波信號。氣囊產(chǎn)生諧波信號的能力與表面的GvpC含量密切相關(guān)，GvpC含量高的氣囊剛性更強(qiáng)，更難產(chǎn)生二次諧波信號。2017年Maresca等［7］采用氣囊進(jìn)行體外、體內(nèi)造影發(fā)現(xiàn)，臨床常用于超聲微泡的非線性對比模式——反轉(zhuǎn)脈沖和振幅調(diào)制可以實(shí)現(xiàn)對氣囊產(chǎn)生的諧波信號進(jìn)行高效地選擇性成像，避免組織背景的散射信號帶來干擾，提高了氣囊的對比度特異性。2020年Maresca等［8］對小鼠進(jìn)行經(jīng)顱神經(jīng)活動(dòng)的血流動(dòng)態(tài)超聲成像發(fā)現(xiàn)，與目前常用的超聲造影微泡聲諾維（SonoVue）相比，氣囊具有更好的成像穩(wěn)定性，可以檢測到更大范圍和更低血流速度的信號。王宇等［9］利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的內(nèi)吞特性和氣囊的聲學(xué)響應(yīng)性，構(gòu)建了具有超聲顯影能力的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可在移植治療后利用超聲成像長時(shí)間追蹤其在小鼠肌肉組織中的分布情況。Le Floc’h等［10］將99mTc與氣囊表面的氨基相互結(jié)合，用以觀察氣囊在小鼠體內(nèi)的分布情況，發(fā)現(xiàn)在注射20 min后，84%的氣囊被肝臟代謝，要實(shí)現(xiàn)體內(nèi)長時(shí)間造影顯像，則需要對氣囊進(jìn)行一定的修飾，以避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）迅速吞噬、清除。Ling等［11］研究發(fā)現(xiàn)，氣囊在肝組織中被巨噬細(xì)胞攝取并經(jīng)溶酶體降解后，回聲信號消失，因此通過檢測注射氣囊后血液循環(huán)和肝臟中超聲強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化可定量評估小鼠肝臟中巨噬細(xì)胞的吞噬和溶酶體降解功能，并在小鼠體內(nèi)驗(yàn)證了該技術(shù)對巨噬細(xì)胞缺乏癥和非酒精性脂肪肝病的診斷價(jià)值。Yan等［12］采用脂肪乳或釓劑GdCl3抑制RES后，延長了氣囊在血液循環(huán)中存在的時(shí)間；采用聚乙二醇（PEG）對氣囊修飾后，避免了其被RES吞噬、清除，顯著延長了氣囊的造影時(shí)間。Wang等［13］采用PEG和透明質(zhì)酸對氣囊進(jìn)行表面修飾，成功制備出了能避免被RES吞噬，且對CD44陽性的SCC7人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系具有靶向性的氣囊，在腫瘤部位實(shí)現(xiàn)了長達(dá)48 h的持續(xù)增強(qiáng)造影。

二、基于氣囊的MRI造影劑

MRI具有較高的組織空間分辨率、多參數(shù)成像等優(yōu)點(diǎn)，是目前臨床常用的影像檢查方法之一。MRI造影劑通過改變局部組織的磁化率，改變其縱向弛豫時(shí)間（T1）和/或橫向弛豫時(shí)間（T2）增強(qiáng)組織對比度，從而提高M(jìn)RI的診斷敏感性和特異性。Lu等［14］發(fā)現(xiàn)，由于氣囊中的空氣與周圍環(huán)境中的水具有不同的磁化率，氣囊的存在使得其周圍液體環(huán)境中的微磁場發(fā)生改變，導(dǎo)致其周圍水中的氫原子共振頻率發(fā)生改變，可產(chǎn)生類似于超順磁性氧化鐵的效果，在MRI檢查中能夠明顯縮短T2，顯著降低T2加權(quán)MRI信號，產(chǎn)生負(fù)性增強(qiáng)顯影效果；聯(lián)合超聲脈沖破壞氣囊，通過氣囊被破壞前后的MRI減影圖像可以獲得來源于氣囊的特異性信號，避免傳統(tǒng)T2增強(qiáng)造影時(shí)原本呈低信號的組織結(jié)構(gòu)（如血管、組織界面等）對病灶信號的干擾。經(jīng)氣囊在小鼠大腦紋狀體的MRI造影顯示，聯(lián)合超聲脈沖的MRI顯著增強(qiáng)了氣囊的對比度特異性?；瘜W(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移（CEST）-MRI是新興的基于飽和質(zhì)子與周圍介質(zhì)中質(zhì)子交換的體內(nèi)分子成像技術(shù)，結(jié)合分子成像和高質(zhì)量解剖成像，在多種代謝物成像方面具有獨(dú)特優(yōu)勢［15］。利用氣囊的氣體自由滲透特性，氣囊能夠與氙氣進(jìn)行化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移作用，當(dāng)應(yīng)用預(yù)載超極化氙氣的氣囊作造影劑時(shí)，其敏感性大大高于基于氫原子的CESTMRI，可在皮摩爾濃度產(chǎn)生明顯的CEST對比度，而基于氫原子的CEST-MRI需在微摩爾濃度時(shí)才能達(dá)到類似的CEST對比度［16］。Kunth等［17］發(fā)現(xiàn)，氣囊裝載的超極化氙氣在體內(nèi)分布遵循理想氣體定律，因而基于超極化氙氣的CEST-MRI成像的信號強(qiáng)度與環(huán)境中的總氙氣的量呈線性關(guān)系，這一特性可以產(chǎn)生基于氙氣濃度的定量CEST-MRI成像的信號。

三、基于氣囊的OCT造影劑

OCT是利用細(xì)胞或組織對光的折射率不同產(chǎn)生不同的光學(xué)信號來進(jìn)行成像的一種新型成像方式，具有較高的時(shí)空分辨率，可以直觀地顯示生物組織的結(jié)構(gòu)特征化學(xué)成分等優(yōu)點(diǎn)。Lu等［18］發(fā)現(xiàn)氣囊特殊的內(nèi)部中空結(jié)構(gòu)使其具有與周圍組織不同的光折射率，導(dǎo)致氣囊對入射光產(chǎn)生強(qiáng)烈的散射，從而產(chǎn)生可用于OCT成像的光學(xué)信號。通過體外造影實(shí)驗(yàn)和對小鼠玻璃體及視網(wǎng)膜下腔的體內(nèi)造影實(shí)驗(yàn)證實(shí)，利用超聲脈沖破壞氣囊后的減影圖像減少了來自內(nèi)源性背景散射的干擾，提高了OCT的對比度特異性。

四、基于氣囊的聲學(xué)報(bào)告基因的研究

報(bào)告基因的產(chǎn)物是一類可用特定成像方式檢測信號的蛋白質(zhì)，其信號強(qiáng)度與表達(dá)量呈正相關(guān)，將報(bào)告基因與目的基因融合或在其同源啟動(dòng)子下實(shí)現(xiàn)共表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)檢測目的基因的表達(dá)水平、研究動(dòng)態(tài)分子信、對細(xì)胞進(jìn)行跟蹤監(jiān)測等目的［19］。Bourdeau等［20］將Ana的GvpA基因和GvpC基因與巨大芽孢桿菌的GvpR-GvpU基因重組，合成了一種新的聲學(xué)報(bào)告基因（ARG1），在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中轉(zhuǎn)導(dǎo)ARG1后，成功表達(dá)出可用于超聲顯影的氣囊。將ARG1導(dǎo)入用于治療腸道疾病的益生菌中后，成功用超聲成像監(jiān)測到其在小鼠腸道內(nèi)的分布情況。相對于傳統(tǒng)的熒光報(bào)告基因的光學(xué)成像，超聲成像能提供更高的空間分辨率，且具有更好的穿透性，可探測到深部組織的信號［21］。Farhadi等［22］利用巨大芽孢桿菌的氣囊基因簇，構(gòu)建了一組哺乳動(dòng)物聲學(xué)報(bào)告基因，轉(zhuǎn)染到人胚胎腎臟細(xì)胞293T中后，成功表達(dá)出可被超聲檢測的氣囊，并驗(yàn)證了其在活體內(nèi)利用超聲成像相關(guān)細(xì)胞分布和生物學(xué)行為的能力。Lakshmanan等［23］構(gòu)建了包含不同酶作用位點(diǎn)的GvpC，利用酶切后氣囊產(chǎn)生非線性信號的能力不同，對酶活性進(jìn)行可視化評估，并成功在體外、益生菌內(nèi)和小鼠胃腸道內(nèi)進(jìn)行成像，顯示出良好的酶活性檢測能力和成像能力。

五、基于氣囊的超聲造影劑在腫瘤治療中的應(yīng)用

超聲靶向微泡破壞技術(shù)是指在超聲實(shí)時(shí)監(jiān)測下，在特定部位利用微泡在不同強(qiáng)度的超聲輻照下產(chǎn)生的空化與聲孔效應(yīng)對細(xì)胞膜的一系列影響，達(dá)到促進(jìn)藥物或基因靶向運(yùn)輸或治療的效果。Szablowski等［24］發(fā)現(xiàn)，氣囊在低頻超聲輻照下可以產(chǎn)生空化效應(yīng)，聯(lián)合低頻超聲輻照和對高表達(dá)αVβ?整合素受體的人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87靶向的RGD-氣囊，其產(chǎn)生的空化效應(yīng)可對腫瘤細(xì)胞造成殺傷作用。另外可將編碼氣囊的基因插入表達(dá)治療性藥物的細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)共表達(dá)，在實(shí)時(shí)超聲監(jiān)測下于特定靶器官中利用氣囊在超聲輻照下產(chǎn)生的空化效應(yīng)將細(xì)菌裂解，在靶器官中釋放出荷載的共表達(dá)藥物，從而實(shí)現(xiàn)靶向給藥。Tayier等［25］采用聚乙烯亞胺對氣囊進(jìn)行表面修飾，構(gòu)建了表面帶正電荷的氣囊，將其作為基因載體。借助氣囊納米級尺寸的優(yōu)勢，可通過血管內(nèi)皮間隙，直接進(jìn)入靶組織細(xì)胞外液與靶細(xì)胞直接接觸，在超聲顯像的實(shí)時(shí)監(jiān)測下聯(lián)合低功率聚焦超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)，可以提高靶組織的轉(zhuǎn)染效率，為基因治療提供了一個(gè)良好的載體。

六、小結(jié)與展望

總之，氣囊作為一種新型的造影劑載體，具有其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，且易于修飾，是制備具有超聲、MRI、OCT、熒光等成像能力的多模態(tài)造影劑的理想材料，但現(xiàn)階段想要投入臨床應(yīng)用仍面臨許多挑戰(zhàn)：目前基于氣囊的影像造影劑尚處于實(shí)驗(yàn)階段，研究模型大多為細(xì)胞和動(dòng)物模型，其在人體應(yīng)用的安全性尚有待驗(yàn)證；另外，如何從基因水平對氣囊進(jìn)行優(yōu)化，制備出針對各種成像方式具有最佳性能的氣囊尚有待研究。氣囊作為造影劑及治療載體具有很大應(yīng)用潛力，隨著研究的深入，其在疾病診療、分子生物研究中將發(fā)揮廣泛的作用。