分子標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)缺點及在豬育種上的應(yīng)用

張云鵬，高 一，張志彬，劉慶雨，張 琪，張樹敏

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130124；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長春 130124）

1 研究背景及意義

我國常見引進(jìn)品種為大約克和長白豬的二元雜交品種，具有明顯的繁殖優(yōu)勢，尤其丹系母豬品種產(chǎn)仔數(shù)可達(dá)到15～18頭，而肥育豬多為杜長大三元雜交，具有良好的生長優(yōu)勢。我國本地品種的優(yōu)良特性，例如松遼黑豬和新吉林黑豬，多為遺傳性穩(wěn)定、適應(yīng)能力強、肉質(zhì)風(fēng)味獨特等特點[1]，但在繁殖性能和生長速度方面相比國外引進(jìn)品種有一定的差距。通過常規(guī)的培育方法改變國內(nèi)品種比較緩慢。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，使用候選基因的標(biāo)記輔助選擇等技術(shù)與常規(guī)的育種技術(shù)相結(jié)合，選擇出有較高繁殖性能的個體，對養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟效益有較大的意義。豬繁殖性能受許多主效基因的影響，如視黃醇結(jié)合蛋白4（RBP4）基因、催乳素受體（PRLR）基因等。標(biāo)記輔助選擇（Marker-Assisted Selection, MAS）是指利用遺傳標(biāo)記輔助選擇控制某一性狀的主效基因或數(shù)量性狀位點（QTL），并進(jìn)一步應(yīng)用于該性狀的選擇。MAS方法的首要任務(wù)是精確定位控制數(shù)量性狀的主效基因或QTL，其中最常用的QTL定位方法之一是候選基因法[2]。因此，從分子遺傳學(xué)及生物學(xué)方面考慮，尋找與豬繁殖和生長性狀相關(guān)的候選基因或遺傳標(biāo)記，可為今后本地品種繁殖和生長性能改良和尋找有效遺傳標(biāo)記位點提供參考依據(jù)。

2 分子標(biāo)記技術(shù)

遺傳標(biāo)記是指可以用來區(qū)分生物個體或群體及其特定基因型的物質(zhì)標(biāo)記，并且可以是遺傳穩(wěn)定的。1970年以前，孟德爾創(chuàng)造了形態(tài)學(xué)遺傳標(biāo)記，后又經(jīng)歷了細(xì)胞遺傳標(biāo)記、免疫遺傳標(biāo)記和生化遺傳標(biāo)記幾個階段。自1970以來，隨著分子遺傳學(xué)的迅速興起，限制性片段長度多態(tài)性、擴增片段長度多態(tài)性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、單核苷酸多態(tài)性等分子標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展，成為新一代遺傳標(biāo)記。分子遺傳標(biāo)記是以核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，在生物體中生長發(fā)育的不同階段均存在。理想的分子標(biāo)記相比于傳統(tǒng)的遺傳標(biāo)記通常具有信息量大、分布廣、穩(wěn)定性強、重現(xiàn)性好、易檢測等優(yōu)勢[2]。

2.1 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）

2.1.1 概念 限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）是一種利用同源DNA序列變異的技術(shù)。用特定的限制性內(nèi)切酶對DNA進(jìn)行消化后，通過存在不同長度的片段來檢測同源DNA分子的差異。在RFLP分析中，DNA樣品用限制性內(nèi)切酶切成片段，然后用瓊脂糖凝膠電泳按片段長度進(jìn)行分離[3]。

2.1.2 優(yōu)缺點 與其他基因分型技術(shù)相比，RFLP具有一些優(yōu)勢。首先，RFLP位點分布在整個基因組中，標(biāo)記具有較高的多態(tài)性。不同的限制性內(nèi)切酶也可用于RFLP。其次，RFLP標(biāo)記是共顯性遺傳，具有高度的重復(fù)性。第三，無論環(huán)境影響和基因互作，RFLP所鑒定的多態(tài)位點在不同品種中都能穩(wěn)定地檢測到。由于這些特性，該方法可以同時篩選大量樣品。此外，DNA印跡可以用不同的RFLP探針進(jìn)行重復(fù)分析。缺點是這項技術(shù)需要用限制性內(nèi)切酶消化DNA，用瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)生的片段，用毛細(xì)管將片段轉(zhuǎn)移到膜上，以及用放射性標(biāo)記的DNA探針進(jìn)行southern印跡雜交。這些過程非常耗時，涉及昂貴的放射性/毒性試劑，并需要大量高質(zhì)量的基因組DNA。近年來，這些缺點限制了RFLP的使用。近年來，人們將PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)相結(jié)合，即PCR-RFLP，有效地彌補了傳統(tǒng)RFLP技術(shù)的諸多不足，大幅簡化了其操作程序[4]。

2.1.3 應(yīng)用 RFLP是第一種DNA標(biāo)記分析技術(shù)，于1975年首次用于識別腺病毒血清型的溫度敏感突變的DNA序列多態(tài)性。廣泛應(yīng)用于基因組作圖和變異分析，如基因指紋、構(gòu)建遺傳圖譜、確定不同性狀的候選基因位置、遺傳疾病診斷和親子鑒定[3]。Short和胡閃耀等[5-6]，利用RFLP-PCR檢測方法分別對4 262頭母豬和633頭美系大白豬、963頭法系大白豬進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)雌激素受體基因（ESR）位點多態(tài)性對母豬總產(chǎn)仔數(shù)及產(chǎn)活仔數(shù)等繁殖性狀有顯著影響。

2.2 簡單序列重復(fù)（SSR）

2.2.1 概念 簡單序列重復(fù)（simple sequence repeat, SSR）標(biāo)記又稱微衛(wèi)星（microsatellite）DNA，微衛(wèi)星，或簡單序列重復(fù)（SSR），基于短（1～6 bp）DNA序列的串聯(lián)重復(fù)序列，這些標(biāo)記由于重復(fù)單位數(shù)的變化而高度多態(tài)。利用針對重復(fù)序列兩側(cè)保守區(qū)的特異引物，可以很容易地檢測特定SSR基因座的重復(fù)長度[7]。

2.2.2 優(yōu)缺點 SSR的高度變異性和共顯性、在基因組中的分散性以及自動化的適用性是廣泛應(yīng)用的主要原因。SSR的主要局限性是在無法獲得現(xiàn)有DNA序列時，分離和鑒定每個基因座所需的時間和成本較高。這一過程需要用SSR特異性探針構(gòu)建和篩選大小選定的DNA片段的基因組文庫，然后對分離的陽性克隆進(jìn)行DNA測序，PCR引物合成和檢測。只有這樣才能確定SSR基因座的拷貝數(shù)、信息量和染色體位置。如果取消文庫篩選，并從每個質(zhì)?？寺≈蝎@得一個以上SSR位點的序列信息，則可以大幅節(jié)省成本和時間[8]。

2.2.3 應(yīng)用 SSR技術(shù)廣泛用于DNA指紋、親子鑒定、連鎖圖譜構(gòu)建和群體遺傳學(xué)研究的分子標(biāo)記[7]。利用SSR技術(shù)探索微衛(wèi)星DNA在豬個體識別和溯源應(yīng)用中的可行性，對家畜屠宰后肉制品的跟蹤、追溯具有重要價值。用于我國地方豬品種的遺傳多樣性，為快速、大規(guī)模評估我國地方豬種遺傳資源提供了新的方法[9]。張彩紅利用SSR技術(shù)對美系杜洛克豬、法系長白豬等5個品種的胰島素樣生長因子1（IGF-1）基因進(jìn)行分型并關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)IGF-1基因位點多態(tài)性平均日增重和個體大小有顯著相關(guān)[10]。

2.3 擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)（AFLP）

2.3.1 概念 擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)（AFLP）是1995年建立的一種高效的基因組指紋技術(shù)。AFLP是基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的遺傳多樣性快速篩選標(biāo)記。整個過程為每個個體生成獨特的DNA指紋。個體間的遺傳差異導(dǎo)致片段的大小和數(shù)量不同。每個DNA片段被稱為一個位點或標(biāo)記，并以其堿基對大小為特征[11]。

2.3.2 優(yōu)缺點 AFLP方法可以從任何生物的DNA中快速產(chǎn)生數(shù)百個高度可復(fù)制的標(biāo)記，因此，它們可以對指紋質(zhì)量進(jìn)行高分辨率的基因分型。由于AFLP每個個體產(chǎn)生大約100個DNA片段，僅根據(jù)長度從凝膠中分離單個感興趣的DNA片段是不可行的。但AFLP的時間和成本效率、可復(fù)制性和分辨率均優(yōu)于或等同于其他標(biāo)記，例如隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、微衛(wèi)星（SSR），只是AFLP方法主要產(chǎn)生顯性標(biāo)記而不是共顯性標(biāo)記。此外，該方法具有較高的鑒別能力和良好的重現(xiàn)性，能夠在物種和品系水平上進(jìn)行有效的鑒別。AFLP指紋沒有必要事先了解微生物的基因組序列。此外，AFLP等位基因可以被熒光標(biāo)記，允許在自動基因組分析儀中對多個樣本進(jìn)行平行表征[11-12]。

2.3.3 應(yīng)用 AFLP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種來源的DNA基因組指紋分析。AFLP是一種有價值的細(xì)菌分類技術(shù)，在物種和菌株水平上具有高分辨能力和良好的重現(xiàn)性。AFLP標(biāo)記由于具有高度的可復(fù)制性和易用性，已成為一種重要的新型遺傳標(biāo)記，在系統(tǒng)學(xué)、病理分型、群體遺傳學(xué)、DNA指紋圖譜和QTL定位等方面有著廣泛的應(yīng)用[12]。另外可利用AFLP標(biāo)記計算親本群體間遺傳關(guān)系，分析其遺傳距離和豬的主要經(jīng)濟性狀雜種優(yōu)勢的相關(guān)性，為豬雜交育種工作進(jìn)展及地方豬種資源合理開發(fā)、篩選最優(yōu)雜交組合提供了理論依據(jù)[13]。

2.4 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）

2.4.1 概念 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）是一種可重復(fù)、快速和非常簡單的方法，用于檢測聚合酶鏈反應(yīng)擴增的DNA中的缺失/插入/重排。SSCP依賴的原理是非變性凝膠中單鏈DNA分子的電泳遷移率高度依賴于其大小和結(jié)構(gòu)。在溶液中，由于單鏈核苷酸之間的堿基配對，單鏈DNA分子呈現(xiàn)二級和三級構(gòu)象。這些構(gòu)象取決于鏈的長度、序列以及堿基配對區(qū)域的位置和數(shù)量。因此，一級序列中特定核苷酸位置的突變可以改變分子的構(gòu)象。當(dāng)在非變性凝膠基質(zhì)中分離時（溫度為101 ℃），可以分辨出單個核苷酸不同的分子，因為不同的構(gòu)象導(dǎo)致它們的遷移率發(fā)生變化。SSCP突變檢測率根據(jù)參數(shù)而變化，例如片段的大小、序列的堿基組成、電泳溫度和/或凝膠組成（即孔徑和交聯(lián)）[14]。

2.4.2 優(yōu)缺點 SSCP方法在技術(shù)上相對簡單，可以有效直觀顯示擴增產(chǎn)物（100～500 bp）內(nèi)部和之間的不同序列類型，并每天快速篩選數(shù)百個樣品。該技術(shù)實用、成本低且省時，還可以通過利用毛細(xì)管電泳而不是平板凝膠的電泳來適應(yīng)高通量形式。但是基于凝膠的小規(guī)模SSCP方案中條帶可以進(jìn)行切除和測序，并且成本適中，這些比基于熒光的復(fù)雜毛細(xì)管SSCP系統(tǒng)更具優(yōu)勢。單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）指紋技術(shù)具有一些優(yōu)點：聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的引物只需要最小的5'端改變；SSCP適用于自動化測序儀中的高通量應(yīng)用；SSCP凝膠電泳中的第二維度可用于獲得高分辨率的2D凝膠。SSCP凝膠電泳的一個關(guān)鍵是嚴(yán)格的溫度控制。在不同溫度下運行的凝膠將產(chǎn)生完全不同的指紋。通過在不同溫度下運行同一模板或通過2D-SSCP凝膠電泳，可以利用這一點改進(jìn)對高度多樣性群落的分析[15-16]。

2.4.3 應(yīng)用 PCR-SSCP是一種新穎且廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和應(yīng)用生物科學(xué)突變檢測的方法。因此，PCR-SSCP被認(rèn)為是一種最新的方法，不僅可以篩選潛在的序列變異，而且可以識別新的突變。此外，它的速度和簡單的檢測這些類似的突變，使其多應(yīng)用在臨床診斷實驗室[17]。吳井生利用PCRSSCP和PCR-RFLP技術(shù)對楓涇豬、梅山豬和大白豬孕酮受體（PGR）基因進(jìn)行多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)PGR基因突變位點不同基因型總產(chǎn)仔數(shù)及產(chǎn)活仔數(shù)有顯著差異[18]。林筱璐利用PCR-RFLP、PCRSSCP技術(shù)對雌激素相關(guān)受體α（ESRRα）、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶相關(guān)肌小節(jié)蛋白-1（CS-1）基因多態(tài)性與豬肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性的研究，ESRRα基因突變位點不同基因型長白豬的肌內(nèi)脂肪含量均差異顯著；而不同基因型杜洛克豬瘦肉率、背膘厚差異顯著，CS-1基因突變位點不同基因型長白豬的瘦肉率、眼肌面積和眼肌厚度有顯著差異[19]。

2.5 單核苷酸多態(tài)性（SNP）

2.5.1 概念 單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）是由個體基因組DNA序列之間相同位置的轉(zhuǎn)換（C/T或G/A）或顛換（C/G，C/A，或T/A，T/G）引起的單核苷酸堿基變異。SNP是遺傳變異的主要DNA多態(tài)性類型，它普遍存在于基因組的基因間隔區(qū)（基因間區(qū)）、基因的編碼序列（外顯子）或基因的非編碼區(qū)（內(nèi)含子、5'非編碼區(qū)、3'非編碼區(qū)或外顯子-內(nèi)含子剪接點）。編碼區(qū)的SNP可分為同義SNP和非同義SNP兩類，后者影響蛋白質(zhì)序列。編碼區(qū)和調(diào)控序列中的單核苷酸多態(tài)性分別對蛋白質(zhì)功能和基因表達(dá)產(chǎn)生重要影響[20]。

2.5.2 優(yōu)缺點 單核苷酸多態(tài)性具有高密度性、成本效益和高通量分析的優(yōu)勢，并易實現(xiàn)自動化，另外還有遺傳穩(wěn)定性好，檢測速度快等優(yōu)點[21]。隨著大量SNP的發(fā)現(xiàn)，而高通量SNP基因分型的需求增加了，其中SNP基因分型技術(shù)包括基于凝膠的低通量方法、裂解擴增多態(tài)性序列（CAPS）標(biāo)記方法、基于PCR的熒光標(biāo)記高通量方法、高分辨率熔融曲線分析（HRM）、TaqMan探針法熒光定量PCR和競爭性等位基因特異性PCR（KASP）、固定陣列系統(tǒng)分析如Illumina Infinuium、Affymetrix Axiom以及新一代測序（NGS）方法，如限制性內(nèi)切酶的測序基因分型（GBS）[22]。

2.5.3 應(yīng)用 SNP在遺傳學(xué)、育種學(xué)、生態(tài)學(xué)和進(jìn)化研究中具有巨大的潛力。在作物遺傳研究中主要用于關(guān)聯(lián)作圖和基因組選擇。例如，在植物遺傳學(xué)中，單核苷酸多態(tài)性已被廣泛用于基于等位基因特異性分析鑒定物種內(nèi)的順式調(diào)控變異，以及發(fā)現(xiàn)與復(fù)雜遺傳性狀相關(guān)的基因。任麗群[23]利用DNA混池和DNA直接測序的方法對宗地花豬經(jīng)產(chǎn)母豬進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)催乳素受體（PRLR）基因外顯子10上5個SNP位點，不同基因型對宗地花豬的總產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)等繁殖性狀均有顯著差異。

3 討論

分子標(biāo)記技術(shù)廣泛用于基因指紋、連鎖圖譜構(gòu)建、群體遺傳學(xué)研究的分子標(biāo)記、遺傳疾病診斷和親子鑒定。在遺傳學(xué)、育種學(xué)、生態(tài)學(xué)和進(jìn)化研究中具有巨大的潛力。在出現(xiàn)疫情時，往往帶來的損失是不可必免的，也是慘痛的。而動物個體對疾病的抵抗力通常是治療中的一個關(guān)鍵問題，如果通過分子標(biāo)記技術(shù)選育出對疾病有較強抵抗力的個體，可以減少一定的損失。利用SNP基因分型尋找個體對疾病反應(yīng)的遺傳原因，將對疫情防控上產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。另外，在動物育種方面，通過分子標(biāo)記技術(shù)尋找與豬繁殖及生長相關(guān)基因的突變位點，分析其多態(tài)性與繁殖及生長性狀關(guān)聯(lián)性，有目的的對群體中具有優(yōu)勢個體進(jìn)行選育，將對養(yǎng)殖行業(yè)帶來很大的經(jīng)濟效益。基因分型技術(shù)正在不斷的創(chuàng)新，這些進(jìn)步以及數(shù)據(jù)挖掘和分析的強大工具帶來的好處將在許多領(lǐng)域得到認(rèn)可。