氫氣防治缺血-再灌注損傷及其機(jī)制研究進(jìn)展

李林，王晨晨，王岱君

（濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖教研室，濰坊 261053）

作為宇宙中最古老和最豐富的分子，氫氣（hydrogen，H2）在傳統(tǒng)上被認(rèn)為是一種生物惰性氣體。1888年，Pilcher等為避免不必要的手術(shù)，將H2注入胃腸道定位內(nèi)臟損傷[1]。此工作僅利用了H2的物理特性而未發(fā)現(xiàn)其生物醫(yī)學(xué)效能。1975年初，Dole等報道在8個大氣壓下，將無毛白化病鱗狀細(xì)胞癌小鼠暴露于97.5%H2和2.5%氧氣的混合物中2周，發(fā)現(xiàn)腫瘤顯著消退，至此H2的生物醫(yī)學(xué)效能首次被發(fā)現(xiàn)[2]。2001年，Gharib等報告，吸入0.7 MPa H2對血吸蟲病相關(guān)慢性肝炎具有治療作用，并認(rèn)為H2的抗炎作用可能是其具有清除羥基自由基（·OH）的能力[3]。2007年，Ohasawa等證實(shí)H2通過選擇性減少PC12細(xì)胞中細(xì)胞毒性·OH起到抗氧化作用，且H2不會與其他具有生理作用活性氧（reactive oxygen species, ROS）發(fā)生反應(yīng)[4]。至此，H2的生物醫(yī)學(xué)效能才引起人們廣泛關(guān)注。

1 氫氣防治缺血-再灌注損傷

一定時間的缺血后血流再灌通，而發(fā)生更為嚴(yán)重的組織損傷被稱為缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury, IRI）。目前研究發(fā)現(xiàn)H2對許多組織器官IRI都具有不同程度的保護(hù)作用。

1.1 心

心血管疾病的死亡率占所有疾病死亡率的1/3，其中缺血性心臟病在治療過程常發(fā)生IRI。H2在防治心IRI中顯示出巨大潛力。Yue等發(fā)現(xiàn)，富氫鹽水（hydrogen-rich saline, HRS）可減輕心IRI，改善心功能[5]。Li等觀察到富氫水（hydrogen-rich water, HRW）可通過多種信號通路調(diào)節(jié)心肌組織代謝失衡，保護(hù)心IRI[6]。Gao等和Pan等則認(rèn)為H2可通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS）和下調(diào)自噬來保護(hù)心IRI，并可能與降低心肌組織中AMPK、mTOR、beclin1、LC3等表達(dá)有關(guān)[7,8]。為提高H2在血液和受損組織中生物利用度，He等開發(fā)超聲可見H2遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)可使H2濃度在常溫常壓下單位體積內(nèi)大大提高[9]。

1.2 肝

肝移植、復(fù)雜肝切除和嚴(yán)重肝外傷手術(shù)中都可能發(fā)生IRI。肝IRI是一個連續(xù)有機(jī)過程，此過程可能會產(chǎn)生嚴(yán)重肝損傷并最終導(dǎo)致病人死亡[10]。

研究表明，通過藥物或小分子激活細(xì)胞關(guān)鍵存活途徑或抑制細(xì)胞凋亡壞死途徑可能有助于降低肝手術(shù)或肝移植IRI[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，吸入低濃度(1%～3%) H2[12,13]及吸入高濃度（66.7%）H2[14]皆能保護(hù)肝IRI。肝臟IRI機(jī)制較為復(fù)雜，在很大程度上仍不清楚。在既往研究中，已發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙、ROS過量產(chǎn)生、鈣超載和磷脂酶激活在肝臟IRI發(fā)病機(jī)制中可能起著重要作用[15]，具有抗氧化、抗炎和保護(hù)細(xì)胞活性的新型藥物可能是保護(hù)肝免受IRI的候選藥物[16]。近期大量研究發(fā)現(xiàn)H2確能通過抗氧化、抗炎等發(fā)揮對肝的保護(hù)作用[14,17]。此外有研究表明，H2可通過減輕ERS[18]、抑制凋亡[19]和減輕肝細(xì)胞自噬[20]來保護(hù)肝。由此可見，給予H2可能是一種對抗肝IRI的有前景的方法。

1.3 肺

肺IRI發(fā)生在各種臨床條件下，例如肺移植、體外循環(huán)和再擴(kuò)張性肺水腫等[21]。肺IRI是一種復(fù)雜的“無菌”炎癥，涉及快速氧化應(yīng)激和肺內(nèi)所有細(xì)胞的后續(xù)反應(yīng)，最終導(dǎo)致內(nèi)皮和上皮屏障破壞，造成危及生命的肺水腫和氣體交換障礙。先天免疫細(xì)胞在肺IRI中起主要作用，它們在再灌注時迅速激活，直接導(dǎo)致組織損傷，并通過產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和相關(guān)分子模式加重炎癥[22]。目前，對于肺IRI尚未有十分有效的治療方法。近期研究發(fā)現(xiàn)，H2可在體外選擇性減少細(xì)胞毒性ROS，如·OH和過氧亞硝基陰離子（ONOO-），并且能在多種動物模型體內(nèi)發(fā)揮治療性抗氧化和抗炎作用[12]，如HRS能減弱肺IRI[23]，減輕肺水腫等[24]。另有研究表明，在肺移植中無論處于暖缺血[25]還是冷缺血階段[26]，H2均可發(fā)揮保護(hù)作用。由此可見，HRS在肺IRI中具有一定的應(yīng)用價值，值得進(jìn)行深入研究。

1.4 腎

腎IRI通常由休克和各種外科手術(shù)引起，臨床甚為常見[27，28]，尋找有效的防治方法非常必要。已有大鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，HRS不但能減輕腎IRI[29,30]，而且還能促進(jìn)IRI后腎功能恢復(fù)[30]，對老年大鼠腎IRI同樣能發(fā)揮較好的保護(hù)作用[31]。除單純H2給予方式外，H2和CO混合給予方式更能明顯減少ROS并顯著改善腎IRI[32]。為推進(jìn)H2臨床研究，Hosgood等在腎IRI臨床前模型上應(yīng)用H2，以觀察H2對腎缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2并沒能改善腎功能、減少氧化損傷或炎癥[33]。目前看來，進(jìn)一步確定H2能否用于臨床治療腎IRI還需進(jìn)行大量研究。

1.5 神經(jīng)系統(tǒng)

腦卒中是全球致殘、致死率高的首要原因之一，80%～85%為缺血性腦卒中，H2作為一種神經(jīng)保護(hù)劑被廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中IRI[34]。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度（66.7%）H2可以降低I/R過程中的氧化應(yīng)激（oxidative stress, OS）水平，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受ROS侵害，改善神經(jīng)功能，降低腦I/R后梗塞率[35,36]。Wu等對大鼠海馬OGD/R損傷神經(jīng)元研究發(fā)現(xiàn)，H2能保護(hù)線粒體功能發(fā)揮保護(hù)作用[37]。此外，H2還能通過上調(diào)Treg細(xì)胞數(shù)量[38]、抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化[39]、促進(jìn)HO-1表達(dá)[40]對腦IRI發(fā)揮保護(hù)作用。一項(xiàng)研究表明，在已有的60多項(xiàng)H2治療多系統(tǒng)疾病的臨床試驗(yàn)中，至少有10項(xiàng)涉及神經(jīng)系統(tǒng)疾病[41]。另有研究表明，H2對周圍神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用同樣得到驗(yàn)證[42,43]。因此，H2在防治神經(jīng)系統(tǒng)IRI中可能具有潛在應(yīng)用價值。

1.6 骨骼肌

在游離組織移植和下肢動脈閉塞期間，骨骼肌中可能發(fā)生IRI[44]。肢體I/R可導(dǎo)致一系列再灌注后綜合征[45]，如擠壓綜合征和筋膜室綜合征等[46]。研究發(fā)現(xiàn)，H2可通過抗氧化、抗凋亡[47]、抗自噬[48]、調(diào)節(jié)iNOS mRNA及eNOS mRNA表達(dá)[49]等，減輕骨骼肌IRI。細(xì)胞鈣和ROS的增加，在缺血期間即已開始，在再灌注時放大，被認(rèn)為是再灌注損傷的主要介質(zhì)[50]。目前，大部分研究都集中于H2抑制過量ROS而并未過多關(guān)注防止鈣超載。大多H2防治骨骼肌IRI的基礎(chǔ)研究還僅停留在有效階段，并未過多涉及防治機(jī)制，相關(guān)機(jī)制研究還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

2 氫氣防治缺血-再灌注損傷的主要作用機(jī)制

H2對IRI的保護(hù)機(jī)制主要涉及到選擇性抗氧化、抗炎、抗凋亡，另外還有抗細(xì)胞焦亡、改善微循環(huán)障礙、調(diào)節(jié)線粒體能量代謝、抑制細(xì)胞自噬及ERS等。

2.1 選擇性抗氧化應(yīng)激

OS是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時，體內(nèi)高活性分子如ROS等產(chǎn)生過多，形成的過量氧化物不能被機(jī)體及時清除，氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷。ROS是真核細(xì)胞主要的內(nèi)源性氧化劑之一，是有氧代謝、細(xì)胞呼吸以及宿主對感染和損傷反應(yīng)等的副產(chǎn)物[51]。在病理狀態(tài)下，氧化還原平衡的改變會導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生增加，進(jìn)而導(dǎo)致氧化損傷。因此，及時消除ROS是十分必要的[52]，有關(guān)H2防治IRI的研究大都集中于ROS。最初Osawa等在細(xì)胞和大鼠OS模型發(fā)現(xiàn)，H2可選擇性還原·OH和ONOO-，H2且不會與其他具有生理作用ROS發(fā)生反應(yīng)[4]。隨后大量研究發(fā)現(xiàn)H2可以中和急性O(shè)S條件下的·OH，產(chǎn)生非常有效的抗氧化作用，改善IRI[17,20,53]。在應(yīng)用抗氧化劑治療時面臨的最大挑戰(zhàn)是如何使抗氧化劑達(dá)到適宜濃度，以針對ROS介導(dǎo)的病理狀況進(jìn)行精確的氧化還原調(diào)節(jié)[54]。由于分子量低，H2可以很容易擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜，迅速到達(dá)產(chǎn)生ROS的線粒體或存儲遺傳信息的細(xì)胞核，因此H2對于清除氧化自由基有著無可比擬的優(yōu)勢。目前，H2的防治分子靶標(biāo)仍然不是很清楚，還需要進(jìn)一步研究。

2.2 抗炎

炎癥反應(yīng)是一個常見病理生理過程，炎癥發(fā)生時會釋放炎癥因子和激活免疫系統(tǒng)。在I/R發(fā)生時，炎癥因子會被過度釋放，從而對細(xì)胞及組織造成損傷。大量研究發(fā)現(xiàn)，H2可以抑制多種炎性細(xì)胞因子分泌及促炎因子基因表達(dá)[14]，也可以降低多種促炎細(xì)胞因子水平，例如趨化因子CCL2、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6和腫瘤壞死因子-α等[3,55,56]。IgE高親和力受體（FcεRI）可引發(fā)下游一系列信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒、釋放趨化因子和細(xì)胞因子等。研究發(fā)現(xiàn)，H2可通過減少FcεRI及其信號通路下游分子磷酸化，抑制IgE與FcεRI結(jié)合導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒和白三烯等炎癥介質(zhì)釋放[57]。此外，H2可以改善活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的積累，減輕炎癥和重塑[58]。還有研究表明H2可以通過PINK1/Parkin介導(dǎo)自噬[59]、活化NF-κB及ERK1/2等[60]以減輕炎癥，從而減少IRI。說明H2可能不僅是一種自由基清除劑，還能夠通過調(diào)節(jié)某些信號通路發(fā)揮抗炎作用。

2.3 抗凋亡

細(xì)胞凋亡是由相關(guān)基因及其產(chǎn)物調(diào)控而發(fā)生的細(xì)胞自主性死亡，存在3種經(jīng)典細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑：外源性（死亡受體）途徑、內(nèi)在性（線粒體）途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。凋亡過程涉及許多高效且特異的蛋白水解，其中半胱天冬酶（Caspase）起著重要的作用，尤其是Caspase-3可以作為凋亡相關(guān)信號通路的匯聚點(diǎn)[61]。Wang等將創(chuàng)傷性脊髓損傷（SCI）大鼠作為研究對象，觀察到HRS處理可以逆轉(zhuǎn)SCI中升高的caspase-3，減輕SCI中細(xì)胞凋亡[62]。B細(xì)胞淋巴瘤2（Bcl-2）家族蛋白控制線粒體膜的通透性，介導(dǎo)內(nèi)在性途徑凋亡。Liu等的研究表明，HRS可通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax，抑制細(xì)胞凋亡因子，促進(jìn)抗凋亡因子，從而改善IRI，提高皮瓣存活率[63]。還有研究顯示，HRW可能通過調(diào)節(jié)JAK2-STAT3信號通路[64]以抑制心I/R導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。上述研究皆表明H2確能通過抗凋亡減輕IRI。

除上述機(jī)制外，H2還可以通過調(diào)節(jié)線粒體能量代謝障礙、減輕ERS[18]、抑制細(xì)胞焦亡及自噬[37]等發(fā)揮抗IRI作用。

3 小結(jié)

上述研究表明H2確實(shí)有益于防治IRI，其機(jī)制也正逐步得以闡明。但H2防治IRI的機(jī)制十分復(fù)雜，仍需進(jìn)行大量深入的研究，且迄今大多數(shù)研究僅限于基礎(chǔ)研究階段，臨床研究有待進(jìn)一步加強(qiáng)，以使H2能夠得到更加廣泛的應(yīng)用。