p16/Ki67和E6/E7 mRNA在宮頸癌篩查中的研究進(jìn)展（綜述）

王 俠

宮頸癌目前已成為僅次于乳腺癌的女性常見惡性腫瘤之一。宮頸癌通常由低級別或高級別的鱗狀上皮內(nèi)病變演變而來，因此早期對女性宮頸癌篩查顯得十分重要。既往的研究是基于巴氏（Pap）涂片的宮頸癌篩查，被廣泛認(rèn)為是最重要的策略，并在過去幾十年中降低了宮頸癌的發(fā)病率和病死率[1]。隨著對分子生物學(xué)和人乳頭瘤病毒（HPV）研究的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了一系列簡便的宮頸癌篩查方法。多數(shù)篩查方法依賴于HPV-DNA的檢測，其中包括第二代雜交捕獲法（HC-2）、Cervista HPV HR和Cobas-HPV。這些方法具有高重復(fù)性和可接受性等優(yōu)點。然而，這些基于DNA的檢測方法往往因其不理想的性能而受到限制。近年來據(jù)報道，免疫組織化學(xué)或原位雜交結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)評價可預(yù)測低級別病變，因此，適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合使用生物標(biāo)記物可以顯著地提高檢測效率以促進(jìn)早期宮頸惡性腫瘤的治療效果。本綜述主要總結(jié)了近五年來國內(nèi)外宮頸癌篩查指標(biāo)p16蛋白、Ki67蛋白、E6/E7 mRNA以及聯(lián)合檢測的相關(guān)研究進(jìn)展，以期在病理方面探尋更佳的宮頸癌篩查方法，為了在浸潤性癌發(fā)生之前發(fā)現(xiàn)并治療宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN），降低宮頸癌轉(zhuǎn)診率，提高臨床診療效率。

1 p16/Ki67在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的診斷價值

p16INK4a（p16）是一種在細(xì)胞周期調(diào)控中起關(guān)鍵作用的抑癌蛋白，是繼p53之后第二常見的腫瘤抑制基因。p16的過度表達(dá)被認(rèn)為是E7表達(dá)不受調(diào)控的替代標(biāo)志物，也作為人類乳頭狀瘤病毒（HPV）感染的指標(biāo)，在HPV相關(guān)腫瘤中高表達(dá)[2]。Ki67是一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物，近年來被發(fā)現(xiàn)其作為分子標(biāo)志物用于不同腫瘤細(xì)胞診斷治療與預(yù)后[3]。生理條件下p16和Ki67蛋白的表達(dá)不會共同發(fā)生，因為它們通常具有相互排斥的表達(dá)效應(yīng)。當(dāng)宮頸上皮內(nèi)共同表達(dá)p16與Ki67時，可能出現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)控失常。因此，在傳統(tǒng)診斷方法的基礎(chǔ)上，可以通過生物標(biāo)記物來提高宮頸癌篩查的準(zhǔn)確性，特別是轉(zhuǎn)化型HPV感染。Ruiyi Zhang等[4]研究表明在CIN2檢測中p16/Ki67雙重染色的特異性為68.33%，顯著高于細(xì)胞學(xué)（38.33%）和HRHPV檢測（21.67%）。在不典型鱗狀細(xì)胞病變中，p16/Ki67雙染的特異性顯著高于HPV檢測，敏感性卻與HPV檢測相似。對于HR-HPV陽性CIN2的敏感性和特異性均高于細(xì)胞學(xué)和 HPV16/18檢測。因此，p16/Ki67雙染實驗提高了CIN2檢測的特異性，相應(yīng)地減少了陰道鏡轉(zhuǎn)診。Qiu-Ping Qian等[5]發(fā)現(xiàn)雙染具有很高的重復(fù)性，且聯(lián)合檢測液基細(xì)胞學(xué)和p16/Ki67雙染色顯示出最高的特異性，這種方法可用于那些潛在受宮頸癌影響的患者的分類診斷中。此外學(xué)者們提出不同陽性率的p16/ Ki67的表達(dá)對CIN分級具有較高的診斷價值，隨著CIN分級的提高，陽性表達(dá)率呈現(xiàn)出逐漸上升的發(fā)展趨勢，且聯(lián)合診斷的敏感性、特異性以及準(zhǔn)確率均高于單獨使用p16診斷宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變[6]。此外，研究發(fā)現(xiàn)液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合p16/Ki67用于診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變的準(zhǔn)確率和敏感性顯著高于單獨檢測組[7]。由此可說明p16/Ki67分子標(biāo)志物可以反映宮頸上皮內(nèi)瘤變的分級，且不同級別表現(xiàn)出不同的特異度。

2 E6/E7 mRNA在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的診斷價值

E6/E7基因的表達(dá)是HPV持續(xù)感染和宮頸惡性轉(zhuǎn)化的必要條件。在宮頸上皮細(xì)胞癌變過程中，HPV將其E6/E7 DNA整合到宮頸上皮細(xì)胞基因組中，使上皮細(xì)胞獲得癌基因，在致癌因子的作用下被激活，轉(zhuǎn)錄成E6/E7 mRNA，并且進(jìn)一步翻譯成癌蛋白E6/E7，它們分別與抑癌蛋白P53和PRB結(jié)合，導(dǎo)致P53和PRB失活，最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。因此，HPV E6/E7 mRNA檢測不僅可以提示HPV感染，而且可以在一定程度上反映E6/E7基因的表達(dá)和病變程度。Ren C等[8]發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)水平是高級別CIN和宮頸癌的危險因素。HPV E6/E7 mRNA定量分析對ASCUS巴氏涂片的診斷具有較高的敏感性和特異性。E6/E7mRNA定量檢測作為ASCUS患者的分型試驗具有較高特異性，可降低為陰道鏡檢查的低轉(zhuǎn)診。Yang L等[9]通過meta分析指出HPV E6/E7 mRNA陽性作為一種不良的預(yù)后因素提示意義不明確的非鱗狀上皮細(xì)胞（ASCUS）的女性處于危險狀態(tài)，應(yīng)及時做陰道鏡轉(zhuǎn)診并加強隨訪。而HPV E6/E7 mRNA陰性的女性可綜合考慮個體差異，減少不必要的陰道鏡檢查，減輕患者的心理負(fù)擔(dān)。此外，采用HPV RNA熒光原位雜交技術(shù)也可以提高CIN診斷形態(tài)學(xué)不明確病例的準(zhǔn)確性[10]。如前所述，p16/Ki67的存在是HPV相關(guān)宮頸癌中HRHPV感染的替代標(biāo)記物。然而，p16INK4a往往導(dǎo)致對染色結(jié)果評判的偏倚，而Ki67在宮頸癌中的診斷價值尚不明確。因此Chen T等[11]研究表明與p16和Ki67免疫雙染相比，HR-HPV E6/E7mRNA原位雜交技術(shù)宮頸癌具有高度的敏感性和特異性。然而最新的研究發(fā)現(xiàn)，薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）聯(lián)合人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測的靈敏度和特異度高于單獨檢測組，具有較高的臨床篩查價值[12]?？傊琀PV E6/E7mRNA定量檢測有望解決HR-HPV DNA檢測特異性低的ASCUS巴氏涂片分流問題，避免不必要的陰道鏡檢查和活檢，降低患者的醫(yī)療費用，減少醫(yī)療資源的浪費。

3 聯(lián)合檢測p16/Ki67與E6/E7 mRNA在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的診斷價值

近年來國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA和p16/ki67免疫細(xì)胞化學(xué)雙染檢測有一定的臨床意義，兩者進(jìn)行聯(lián)合檢測明顯提高了分流診斷的靈敏度和特異度。此外，相比于單獨檢測，聯(lián)合應(yīng)用明顯提高了CINⅡ(+)病變的靈敏度，提高了篩查效率，具有一定的臨床應(yīng)用價值[13]。然而Zhu Y等[14]發(fā)現(xiàn)p16/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)和HPV E6/E7 mRNA檢測都比HPV DNA檢測有更高的特異性，而p16/Ki67免疫細(xì)胞化學(xué)比HPV E6/E7 mRNA檢測具有更高的敏感性。針對兩者聯(lián)合檢測對宮頸癌篩查及分型仍需進(jìn)一步探索。

p16基因是一種腫瘤抑制基因，位于人類第9號染色體上，其產(chǎn)物p16蛋白在細(xì)胞增殖與分裂過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。許多文獻(xiàn)指出，p16蛋白在不同宮頸上皮內(nèi)瘤變中存在差異，且與CIN病變程度呈正相關(guān)。此外，p16表達(dá)水平與HPV感染密切相關(guān)。Ki67是一種與細(xì)胞周期密切相關(guān)的細(xì)胞核增殖性抗原，被發(fā)現(xiàn)可能與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，并反映腫瘤細(xì)胞增殖活性[15]。臨床上人們通過實驗證明p16/Ki67雙染對宮頸上皮內(nèi)瘤變的診斷意義較大，具有較高的敏感性與特異性，可推薦在臨床上用于CIN分級診斷。

高危型HPV持續(xù)感染狀態(tài)被認(rèn)為是宮頸癌的最主要病因。HR-HPV的基因組參與病毒自身的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程，其晚期區(qū)負(fù)責(zé)編碼HPV衣殼蛋白，在上皮細(xì)胞的內(nèi)吞過程中發(fā)揮重要作用。E6蛋白作用于p53基因，控制基因表達(dá)過程中的各個環(huán)節(jié)。E7基因編碼的蛋白主要是結(jié)合到腫瘤抑制蛋白Rb上而引起了Rb降解，導(dǎo)致E2F轉(zhuǎn)錄因子以游離形式存在，激活參與細(xì)胞周期的相關(guān)基因，最終導(dǎo)致細(xì)胞呈增殖狀態(tài)。宮頸HPVDNA檢測陽性只能表明病毒存在，而HPV E6/E7 mRNA檢測陽性可說明病毒已整合入宮頸上皮細(xì)胞基因組內(nèi)并發(fā)生了基因表達(dá)，處于持續(xù)性感染的狀態(tài)。宮頸上皮內(nèi)病變患者存在HPV E6/E7 mRNA異常高表達(dá)，且宮頸上皮內(nèi)病變分級是宮頸錐切術(shù)后疾病持續(xù)復(fù)發(fā)的高危影響因素，可隨病變程度的增加而上升，因此，高級別宮頸上皮內(nèi)病變發(fā)生宮頸癌的危險性較大。Pruski D等[16]研究發(fā)現(xiàn)高級別鱗狀上皮內(nèi)病變與HPV E6/E7 mRNA陽性密切相關(guān)，故HPV E6/E7 mRNA是鑒別腫瘤病變和宮頸癌相關(guān)性的重要依據(jù)且檢測靈敏度和特異性隨著年齡的增長而增加。

4 小結(jié)與展望

診斷早期宮頸癌的不可或缺的環(huán)節(jié)是宮頸上皮內(nèi)瘤變。因此，早期發(fā)現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)瘤變對預(yù)防宮頸癌極其重要。目前國際公認(rèn)準(zhǔn)則采用三階梯宮頸癌篩查程序，即宮頸涂片細(xì)胞學(xué)檢查、陰道鏡檢查、宮頸組織病理學(xué)檢查，使得宮頸癌的檢出率顯著提高。然而宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查往往根據(jù)病理科醫(yī)師自身經(jīng)驗進(jìn)行診斷，具有主觀性，易造成假陽性或假陰性。組織活檢雖作為診斷宮頸病變的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但屬于有創(chuàng)檢查，不利于大面積篩查。本綜述旨在總結(jié)近年來臨床上宮頸癌篩查中常用的簡便可靠的分子標(biāo)志物的特點及臨床應(yīng)用價值，目的是為臨床宮頸癌篩查提供重要的分子診斷依據(jù)。檢測HPV E6/E7 mRNA對早期診斷宮頸癌具有重要意義。然而，學(xué)者們并不僅僅局限于這幾類標(biāo)志物的檢測[17]，越來越多用于宮頸癌篩查的生物標(biāo)志物將被逐步發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用。通過檢測p16/Ki67、HPV E6/E7 mRNA，探討其在宮頸癌篩查中的作用，從而了解分子生物學(xué)技術(shù)用于宮頸癌篩查與早期診斷，為臨床應(yīng)用提供了堅實的理論依據(jù)。