基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討芪蓮益腎膏治療慢性腎臟病的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

王彥芳 史宏碩 張穎穎 楊田田,2 司國(guó)民,2

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250355；2.山東省立醫(yī)院中醫(yī)科，山東濟(jì)南 250021

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是由多種原因?qū)е碌哪I臟結(jié)構(gòu)和功能異常[1]。其全球平均發(fā)病率為9.1%，我國(guó)患病總?cè)藬?shù)高達(dá)1.32 億[2]。如何延緩CKD 進(jìn)程一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，具有重要價(jià)值和意義。

芪蓮益腎膏（原名參芪解毒膏）是山東省立醫(yī)院的院內(nèi)制劑，其藥物組成為黃芪、丹參、當(dāng)歸、酒大黃、芡實(shí)、墨旱蓮、天葵子、白茅根、生牡蠣、仙靈脾、金櫻子、白花蛇舌草、阿膠，具有補(bǔ)腎健脾、活血化瘀、化濁解毒之功，本課題組前期研究證實(shí)，該方可改善CKD患者腎臟功能、延緩CKD 進(jìn)程[3]；芪蓮益腎膏聯(lián)合P311 可改善腎纖維化[4-7]。免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子可促進(jìn)纖維母細(xì)胞增生，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化形成[8]。芪蓮益腎膏是否可通過(guò)下調(diào)促腎纖維化的免疫細(xì)胞的分化及細(xì)胞因子的產(chǎn)生而延緩CKD 進(jìn)程，值得研究。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，篩選芪蓮益腎膏治療CKD 的核心靶標(biāo)及免疫相關(guān)通路，建立“活性成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行初步驗(yàn)證，探究芪蓮益腎膏治療CKD 可能的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 芪蓮益腎膏活性成分的篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）[9]分別搜索芪蓮益腎膏所含的13 味中藥的主要化學(xué)成分。

1.2 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)篩選

利用TCMSP、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）[10]數(shù)據(jù)庫(kù)查找藥物有效成分的作用靶點(diǎn)，UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）[11]標(biāo)準(zhǔn)化靶點(diǎn)信息，物種選“Homo sapiens”，得到芪蓮益腎膏的作用靶點(diǎn)。同時(shí)，分別以“chronic renal failure”“chronic kidney diseases”“Renal Insufficiency，Chronic”為檢索詞，利用DrugBank、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）[11]、CTD（http：//ctdbase.org/）[11]（Inference Score ≥50%）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）[11]（Relevance score≥50%）數(shù)據(jù)庫(kù)篩選CKD 的相關(guān)靶點(diǎn)。利用在線維恩圖[9]取藥物靶點(diǎn)和疾病的靶點(diǎn)的交集，即為芪蓮益腎膏作用于CKD 的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 芪蓮益腎膏活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將芪蓮益腎膏的活性成分與對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件[10]，成分或靶點(diǎn)用節(jié)點(diǎn)表示，成分和靶點(diǎn)間的關(guān)聯(lián)用邊表示，得到芪蓮益腎膏活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并利用Network analyzer 功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋵傩赃M(jìn)行分析。

1.4 GO 生物過(guò)程和KEGG 信號(hào)通路富集分析

將芪蓮益腎膏活性成分作用于CKD 的相關(guān)靶點(diǎn)，通過(guò)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）[12-13]進(jìn)行GO 生物過(guò)程分析，選中3 個(gè)子類(lèi)，分別為細(xì)胞組分（cellular component，CC）、生物過(guò)程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF），并利用Cytoscape 3.2.1 中的ClueGo 插件對(duì)KEGG 信號(hào)通路富集分析，篩選可能與治療CKD 相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)通路，構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，將此網(wǎng)絡(luò)與“1.3”構(gòu)建的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)合并，獲得成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.5 分子對(duì)接

利用Uniprot PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)查找主要信號(hào)通路相關(guān)蛋白的PDB 格式，將mol2 格式的治療CKD 的芪蓮益腎膏的主要化學(xué)成分導(dǎo)入LeDock[14]進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 芪蓮益腎膏活性成分的篩選

截至2020 年12 月，初步檢索到黃芪87 種，丹參202 種，當(dāng)歸125 種，大黃92 種，芡實(shí)26 種，墨旱蓮48 種，天葵子84 種，白茅根33 種，淫羊藿130 種，金櫻子48 種，白花蛇舌草37 種，未檢索到生牡蠣和阿膠的化學(xué)成分。利用口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類(lèi)藥性（drug likeness，DL）≥0.18 為條件篩選，共得到芪蓮益腎膏的有效成分144 種。各藥間的共同成分（共10 種）見(jiàn)表1。

表1 芪蓮益腎膏各藥間的共同成分信息

2.2 芪蓮益腎膏活性成分治療CKD 相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

檢索到芪蓮益腎膏144 種有效成分的2082 個(gè)靶點(diǎn)，去除各成分間的共同靶點(diǎn)，共得到261 個(gè)成分相關(guān)靶點(diǎn)。篩選出313 個(gè)CKD 相關(guān)靶點(diǎn)。二者交集得到的83 個(gè)靶點(diǎn)，即為芪蓮益腎膏活性成分治療CKD 的相關(guān)靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 芪蓮益腎膏靶點(diǎn)與慢性腎臟病靶點(diǎn)維恩圖

2.3 芪蓮益腎膏活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析

將藥物活性成分和作用于CKD 的相關(guān)靶點(diǎn)構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖2）。菱形代表活性成分，共109 個(gè)，圓形代表靶點(diǎn)，共83 個(gè)。靶點(diǎn)數(shù)較多的前三位化學(xué)成分分別是槲皮苷（quercetin）、木樨草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol），靶點(diǎn)數(shù)分別為68、31、27，其可能是芪蓮益腎膏治療CKD 的關(guān)鍵化學(xué)成分。

圖2 芪蓮益腎膏有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 生物過(guò)程和KEGG 信號(hào)通路富集分析

以P ＜0.01 為篩選條件，富集在CC 的條目為11 個(gè)，BP 的條目為73 個(gè)，MF 的條目為12 個(gè)，按P 值升序，靶點(diǎn)所富集的這3 個(gè)子類(lèi)中的前10 個(gè)條目見(jiàn)圖3。

圖3 芪蓮益腎膏治療慢性腎臟病靶點(diǎn)GO 生物過(guò)程富集分析

KEGG 信號(hào)通路富集分析圖見(jiàn)圖4。篩選出P ＜0.01 的通路91 條，與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的通路主要包括IL-17、TNF、Th17 細(xì)胞分化、NF-κB、JAKSTAT 等。通過(guò)Cytoscape 軟件構(gòu)建芪蓮益腎膏治療CKD 免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。芪蓮益腎膏中有102 種活性成分作用于39 個(gè)靶點(diǎn)，通過(guò)IL-17、TNF、Th17 細(xì)胞分化、NF-κB、JAK-STAT等免疫相關(guān)通路發(fā)揮作用。

圖5 芪蓮益腎膏治療慢性腎臟病成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 分子對(duì)接

根據(jù)KEGG 分析結(jié)果，筆者推測(cè)調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡可能是芪蓮益腎膏治療CKD 的機(jī)制之一。Th17和Treg 的主要轉(zhuǎn)錄因子分別為RORγt 和Foxp3。將mol2 格式的3 種主要活性成分（槲皮素、木樨草素、山柰酚）和PDB 形 式的2 種重要靶點(diǎn)（RORγt 和Foxp3）導(dǎo)入LeDock 進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果顯示，這三種活性成分和這兩種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能均小于零，提示活性成分可以自發(fā)地與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)作用（表2）。對(duì)接示意圖見(jiàn)圖6。

圖6 主要活性成分與Foxp3、RORγt 對(duì)接示意圖

表2 主要活性成分與Foxp3、RORγt 的結(jié)合能（kcal/mol）

3 討論

腎臟病的發(fā)病及病程進(jìn)展與免疫功能紊亂密切相關(guān)[15]，炎癥及微炎癥狀態(tài)是造成免疫功能失調(diào)的基礎(chǔ)[16]。微炎癥[17]是免疫性炎癥，與炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。已有學(xué)者[18-23]研究證實(shí)，CKD 患者體內(nèi)存在微炎癥，IL-17 水平升高，通過(guò)下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，如CRP、IL-6、TNF-α，可有效延緩CKD 患者腎纖維化進(jìn)展。在T 細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中，IL-17 是炎癥細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)中的早期啟動(dòng)因子，Th17/Treg 比例失衡是微炎癥的主要機(jī)制之一[24]。Th17、Treg 分化分別受IL-6/JAK2/STAT3/RORγt、IL-2/JAK3/STAT5/Foxp3調(diào)控[25-27]。Th17 細(xì)胞可分泌IL-17，IL-17 可誘導(dǎo)IL-6、TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，引起局部炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及組織損傷。IL-17 與IL-17R 結(jié)合，可活化接頭分子TRAF6，通過(guò)NF-κB 通路發(fā)揮生物學(xué)作用。

綜上，芪蓮益腎膏可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用延緩CKD進(jìn)展，發(fā)揮作用的主要成分可能是檞皮素、木犀草素、山柰酚等，涉及到的關(guān)鍵通路有IL-17、TNF、Th17 細(xì)胞分化、NF-κB、JAK-STAT 通路，對(duì)Th17/Treg 平衡的調(diào)節(jié)可能是其作用機(jī)制之一。但具體而深入的作用機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明。