長鏈非編碼RNA與多囊卵巢綜合征關系的研究進展

許嘯虎，鄭翠紅，周儷姍

長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA）是指長度超過200個核苷酸，而不參與蛋白質編碼功能的一類RNA。盡管目前已鑒定出的數千個lncRNA中只有少數有功能，但是這些lncRNA卻是人類疾病和生長發(fā)育的關鍵調節(jié)因子?？梢哉flncRNA的發(fā)現極大地改變了我們對人類遺傳學的理解，其活性改變與許多生物學過程，如生長發(fā)育、細胞增殖、分化和凋亡息息相關，也對多種疾病，如糖尿病、心血管、神經系統疾病和腫瘤疾病等產生重要影響。越來越多的證據也表明，lncRNA與女性生殖系統疾病密切相關，在各種婦科腫瘤包括宮頸腫瘤、子宮內膜腫瘤和卵巢腫瘤等的發(fā)病機制中發(fā)揮作用[1-2]。此外，還發(fā)現lncRNA與一些不良妊娠結局，如自然流產、先兆子癇和胎膜早破有關[3-4]。而多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡婦女無排卵性不孕的常見原因，在世界范圍內患病率約為8%～13%[5]。PCOS特征為無排卵或稀發(fā)排卵、高雄激素血癥和卵巢多囊樣改變，同時罹患不孕、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和2型糖尿病、心血管疾病和子宮內膜癌的風險增加。雖然PCOS的病因仍未完全明確，但大多數研究者認為PCOS是多因素致病，其中遺傳因素在其發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用[6]。本文就近年來lncRNA與PCOS的關系作一綜述，希望能為PCOS的診斷和治療研究提供新的思路。

1 多種lncRNA在PCOS中存在差異表達

近年來關于lncRNA與PCOS關系的報道日益增多，這些研究表明lncRNA的過度表達或缺失與PCOS有關。Fu等[7]對來曲唑誘導的PCOS大鼠和正常大鼠卵巢組織mRNA和lncRNA的表達進行測序比較，共檢測到2 147個mRNA和158個lncRNA的差異表達。進一步通過實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real -time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析確認了其中8個表達差異有統計學意 義 的lncRNA：lncRNA Abcf2 -004、Cd36 -005、Col6a3 -201 和RT1 -CE5 -002、RT1 -M3 -1 -002、Urgcp-002、Grik2-001和Adgrv1-003，提示這些異常表達的lncRNA可能參與了PCOS的發(fā)病。Liu等[8]使用基因芯片技術比較了7例PCOS患者和7例健康女性的卵巢顆粒細胞（granulosa cells，GCs）中l(wèi)ncRNA的表達。發(fā)現在PCOS患者中共有862個lncRNA與非PCOS女性相比表達存在差異，其中692個表達上調，170個下調。Huang等[9]同樣利用基因芯片技術比較了接受體外受精（in vitro fertilization，IVF）治療的35例PCOS 患者和35 例非PCOS 患者的卵丘細胞（cumulus cells，CCs）中l(wèi)ncRNA的差異，發(fā)現PCOS患者和非PCOS患者的卵丘細胞中共有623個lncRNA和260個mRNA表達不同，其中有620個lncRNA在PCOS患者中呈現高表達，3個呈現低表達。并且大多數差異表達的lncRNA是由2號染色體轉錄，說明位于2號染色體上的基因可能與PCOS發(fā)生發(fā)展有著密切關系，也反映了在PCOS發(fā)病機制中遺傳因素的重要性。

2 LncRNA與PCOS性激素分泌的關系

高雄激素血癥是PCOS的重要特征之一，然而對PCOS患者的lncRNA參與雄激素過多分泌的分子機制尚不清楚。Che等[10]發(fā)現并鑒定了一個位于染色體15q25上的新的lncRNA（lnc-ZSCAN2-5:15），并將其命名為HUPCOS，他們將KGN細胞（人卵巢顆粒細胞瘤細胞）作為研究對象，采用基因芯片技術比較了PCOS和非PCOS女性卵巢顆粒細胞中的HUPCOS的表達，發(fā)現在PCOS患者顆粒細胞中HUPCOS顯著升高，并且與其卵泡液中睪酮濃度呈正相關。而抑制HUPCOS的表達可以使芳香化酶的表達增加，促進了雄激素向雌激素的轉化，降低了雄激素分泌。提示HUPCOS可能通過抑制芳香化酶的表達，導致PCOS患者卵泡液中的雄激素濃度升高。

和大多數lncRNA一樣，lncRNA HCG26主要分布于細胞核中，其與代謝綜合征密切相關。為了解lncRNA HCG26與PCOS的關系，Liu等[8]用qRT-PCR檢測了接受IVF或胞漿內單精子注射（ICSI）治療的53例PCOS患者和50 例非PCOS患者顆粒細胞中HCG26的表達，結果顯示其在PCOS患者中顯著上升，并與竇卵泡數量呈正相關。而在KGN細胞中敲除HCG26能夠明顯抑制細胞增殖和細胞周期進程，增加芳香酶基因的表達和雌二醇的產生，說明lncRNA HCG26很可能參與PCOS的發(fā)展。

另一個與PCOS 患者性激素分泌相關的是lncRNA SRA，其是一種能調節(jié)各種轉錄因子同時也能夠增強激素相關受體（如雌激素受體α和雄激素受體）基因表達的RNA，在PCOS患者外周血白細胞中表達升高，提示lncRNA SRA可能與PCOS有關。為進一步探索lncRNA SRA在PCOS中的作用，Li等[11]首先從小鼠卵巢分離出顆粒細胞，并通過慢病毒轉染的方法在該細胞系中過表達SRA，通過實時聚合酶鏈反應（real-time PCR）、細胞增殖（cell counting kit-8，CCK-8）檢測、流式細胞術、Hoechst染色和蛋白質印跡技術進行檢測，評估了SRA對顆粒細胞的影響。結果顯示SRA高表達能夠刺激顆粒細胞的生長，表現為細胞周期蛋白Cyclin B、Cyclin E和Cyclin D1的增加，并通過上調B淋巴細胞瘤2（BCL2）和下調Bcl-2相關X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3（Caspase3）和多腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的表達來抑制細胞凋亡。此外，雌二醇和孕酮的含量以及它們合成的關鍵酶（如CYP19A1和CYP11A1）的表達隨著SRA的過度表達而上調，表明SRA異常升高可能是誘發(fā)PCOS的一個危險因素。另一項研究則采用慢病毒轉染技術沉默PCOS 小鼠卵巢中l(wèi)ncRNA SRA的表達，發(fā)現可以改善PCOS小鼠的胰島素釋放，減輕卵巢損傷，減少血管生成因子的產生；還可以抑制脫氫表雄酮（DHEA）誘導的PCOS小鼠的卵巢初級顆粒細胞中腫瘤壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子的產生和核因子κB（NF-κB）的核易位[12]。因此，lncRNA SRA在PCOS的發(fā)展中起著重要的作用，可能作為PCOS藥物治療的靶點。

3 LncRNA與PCOS胰島素抵抗的關系

PCOS患者存在內分泌和代謝異常，其中大約70%的PCOS婦女存在IR，表現為體質量增加、體質量指數（BMI）升高、代償性高胰島素血癥，這也增加了罹患2型糖尿病、心血管疾病和其他代謝功能障礙疾病的風險。LncRNA GAS5是新近發(fā)現的腫瘤抑制因子，在多種癌癥（如乳腺癌、前列腺癌、肺癌和結腸直腸癌）中發(fā)揮腫瘤抑制作用。最近發(fā)現lncRNA GAS5還可以影響肌肉細胞中的葡萄糖代謝、糖異生過程和肝臟葡萄糖輸出，與2型糖尿病發(fā)病密切相關[13]。但是研究者對其在PCOS-IR中的作用知之甚少。Lin等[14]為此收集了30例非PCOS患者和46例PCOS患者的血清樣本，測量與IR相關的炎性因子白細胞介素18（IL-18）和GAS5的表達，結果顯示PCOSIR患者血清中IL-18濃度顯著升高，而GAS5表達降低。相關性分析表明胰島素抵抗指數（HOMA-IR）與GAS5表達呈負相關，與IL-18濃度呈正相關，說明lncRNA GAS5可能參與了PCOS患者IR的發(fā)展。

LncRNA H19是一種能夠調節(jié)多種轉錄因子之間相互作用的lncRNA，在基因轉錄、核糖核酸代謝和腫瘤發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。其還與子宮內膜異位癥和男性不育有關，在胰島組織中的表達下調可能是IR的潛在機制，那么lncRNA H19是否與PCOS的發(fā)病機制有關值得進一步研究。Qin等[15]使用qRTPCR檢測了20例PCOS患者和20例健康女性外周血白細胞中l(wèi)ncRNA H19的表達，以探索lncRNA H19和PCOS內分泌紊亂的潛在關系，發(fā)現PCOS患者H19的表達顯著高于健康女性，并且其過高表達與PCOS顯著相關。此外，H19高表達也與空腹血糖水平呈正相關，然而與總睪酮或IR均無顯著相關性。這表明lncRNA H19可能是PCOS內分泌和代謝紊亂的早期階段一種有用的生物標志物。

4 LncRNA與PCOS卵泡發(fā)育和排卵障礙的關系

卵泡的正常發(fā)育和卵子的順利排出是一個受多種因素影響的復雜過程，也是影響妊娠的主要原因。PCOS約占無排卵性不孕癥病例的75%以上，其關鍵特征即是卵泡發(fā)育或排卵障礙，表現為卵泡發(fā)育的各階段都有很多的生長卵泡，但是最終不能形成成熟優(yōu)勢卵泡。雖然其潛在的分子機制仍不清楚，但是近年來對于lncRNA在卵泡發(fā)育和排卵障礙中作用的研究逐漸增多。

LncRNA PWRN2最初是在睪丸組織中發(fā)現的，在精子生成的減數分裂階段后其表達上調，因此與男性生殖能力有關。但Huang 等[16]發(fā)現lncRNA PWRN2在PCOS患者卵丘細胞中的表達相當于健康人群的3.11倍，為了進一步明確PWRN2在PCOS中的分子機制，他們采用qRT-PCR檢測卵丘細胞中PWRN2的表達水平，并通過3個微陣列數據庫構建了一個PWRN2介導的PWRN2/miR-92b/TMEM120B競爭性內源RNA （competing endogenous RNA，ceRNA）網絡，以研究其在PCOS卵母細胞成熟中的潛在作用機制。TMEM120B的升高能夠促進脂肪細胞分化和代謝并誘導肥胖，并且已被證明與受精失敗的卵母細胞發(fā)育異常有關，而微小RNA-92b-3p（miR-92b-3p）能夠與TMEM120B mRNA直接結合并抑制TMEM120B表達。該研究結果顯示PCOS患者未成熟卵母細胞PWRN2的轉錄水平高于其在成熟階段卵母細胞中的表達，說明PWNR2可能與PCOS卵母細胞成熟相關。PWNR2可以降低miR-92b-3p對TMEM120B的靶向結合能力進而導致TMEM120B表達增加，可能是PCOS卵母細胞異常發(fā)育的分子機制。

5 LncRNA與PCOS卵巢顆粒細胞增殖和凋亡的關系

生殖細胞的增殖和分化是卵巢發(fā)育的必要過程，顆粒細胞在卵母細胞發(fā)育過程中作用明顯，為卵母細胞提供所必需的營養(yǎng)和生長因子。而PCOS患者卵泡周圍的顆粒細胞層顯示閉鎖、退化和肥大的跡象，提示顆粒細胞存在異常增殖或凋亡，這將導致PCOS的卵泡發(fā)育和排卵障礙。

LncRNA既然是發(fā)育、分化、細胞增殖和凋亡的關鍵調節(jié)因子，因此可以推測與細胞周期相關的lncRNA在卵巢顆粒細胞發(fā)育中起著重要作用。比如lncRNA GAS5的上調可以導致細胞周期停滯，已經被證實參與多種疾病相關的細胞凋亡和增殖，其可能在顆粒細胞增殖中也發(fā)揮同樣作用進而參與PCOS的發(fā)展[14]。

LncRNA BANCR是一種在惡性腫瘤中研究比較充分的lncRNA，但是其與PCOS的關系尚不清楚。Yang等[17]運用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測了PCOS患者和非PCOS患者IVF過程中顆粒細胞中BANCR的表達。結果顯示，與非PCOS患者相比，PCOS患者顆粒細胞中BANCR的表達水平顯著增高。隨后用胰島素分別干預顆粒細胞和KGN細胞，發(fā)現BANCR的表達顯著提高。而在KGN細胞中通過轉染過表達BANCR，分別檢測促凋亡因子Bax和p53的表達水平，發(fā)現兩者的表達水平顯著提高，可以說明BANCR通過上調Bax和p53來促進PCOS卵巢顆粒細胞凋亡，進而參與PCOS的發(fā)展。

LncRNA HCP5主要通過對靶向miRNA的調節(jié)作用，影響這些miRNA下游分子的表達和功能，其在包括膠質母細胞瘤、甲狀腺癌、宮頸癌和結腸直腸癌在內的多種癌癥發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。PCOS患者的HCP5表達水平高于非PCOS婦女，但是其在PCOS的潛在功能和調控機制尚不清楚[8]。胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是KGN細胞增殖的正調節(jié)因子，能夠影響卵巢發(fā)育并增加雄激素的產生。MiR-27a-3p的過表達可以通過抑制SMAD5的表達，來抑制KGN細胞的增殖并促進其凋亡[18]。研究發(fā)現HCP5可以通過和miR-27a-3p的競爭性相互作用上調IGF-1的表達，促進顆粒細胞增殖，進而參與PCOS的發(fā)展。因此，HCP5/miR-27a-3p/IGF-1通路可能成為今后PCOS治療的潛在靶點[19]。而在另一項研究中則報道HOTAIR通過競爭性結合miR-130a上調IGF-1的表達，進而引起內分泌紊亂和顆粒細胞凋亡[20]。

LncRNA LINC-01572:28是另一個在睪丸中高表達的lncRNA。Zhao等[21]研究發(fā)現在PCOS婦女的黃體化顆粒細胞（luteinized granulosa cells，hLGCs）中，LINC-01572:28和p27蛋白表達升高，并且LINC-01572:28表達與基礎睪酮水平呈正相關，其過度表達阻礙了細胞周期G1/S的轉換并抑制細胞增殖。這種作用可能是通過與SKP2的競爭性結合阻礙了SKP2和p27之間的相互作用，導致p27積累后反過來誘導細胞周期停滯，從而抑制顆粒細胞增殖。

LncRNA SRLR是一種在腎細胞癌中新近發(fā)現的癌基因，然而在其他疾病中的功能仍不清楚。Li等[22]對比了48例健康女性和52例PCOS患者血漿中SRLR和IL-6的水平，發(fā)現PCOS患者血漿中的SRLR和IL-6顯著升高，并且SRLR蛋白的水平與IL-6的表達呈正相關。而SRLR的過度表達促進了KGN細胞的凋亡，說明其可能通過調節(jié)KGN細胞的凋亡和炎癥反應參與PCOS的發(fā)展。

6 LncRNA與PCOS肥胖的關系

眾所周知，肥胖和PCOS有著密切的聯系，在PCOS的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用。LncRNA SRA是由Sra1基因編碼的類固醇受體核糖核酸激活劑，能夠調節(jié)多種轉錄因子表達，并增強性激素受體的轉錄活性。LncRNA SRA參與增殖、凋亡、脂肪生成、性激素合成和胰島素信號傳導等多種生物學過程[11,23]。為了了解lncRNA SRA是否與PCOS有關，Liu等[23]對比了23例PCOS患者和17例健康女性外周血白細胞中SRA水平，并分析了其與PCOS多項內分泌指標的相關性。發(fā)現在PCOS婦女中，外周血白細胞的SRA表達顯著高于健康人群，并且與BMI呈正相關，提示lncRNA SRA的表達與PCOS合并肥胖有潛在聯系，可能部分地促進了PCOS的發(fā)展。

7 結語與展望

綜上所述，盡管起初lncRNA被認為是人類基因組中轉錄的“噪音”，但是隨著生命科學研究技術的日漸成熟，越來越多的lncRNA及其相關功能得到了更好地認識。如今已經證實lncRNA的表達和功能障礙與PCOS密切相關，在性激素分泌、IR、卵泡發(fā)育、顆粒細胞增殖與凋亡中發(fā)揮作用，幾乎參與了PCOS發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)，很可能成為今后PCOS診斷與治療的靶點。雖然近年來相關的研究取得一定進展，但是我們也應看到其中存在的一些不足之處。首先，相對于lncRNA在腫瘤中的研究，其在婦科生殖領域特別是PCOS仍處于起步階段，已經確認的與PCOS相關的lncRNA仍相對較少；其次，對于與PCOS相關的lncRNA 的功能與具體作用機制仍未完全闡明。除此之外，針對PCOS相關lncRNA 作為靶點的輔助診斷或藥物治療的研究很少，這些都需要今后更深入的挖掘，以共同促進PCOS診治水平的提高。