熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用進(jìn)展

李 波，蔣慧嫻，楊 瑾，任志彬，商建成

（1.廊坊海關(guān)，河北廊坊 065000；2.張家口海關(guān)，河北張家口 075000；3邯鄲海關(guān)，河北邯鄲 056000）

常規(guī)PCR技術(shù)在應(yīng)用過程中暴露出了許多的問題，如假陽(yáng)性、環(huán)境污染問題等，這些問題的存在限制了PCR技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。而熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)是當(dāng)前社會(huì)最常用的動(dòng)物檢疫的方法，它本身是很難被替代的，科研人員需嘗試找到并解決熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)中存在的缺陷，并進(jìn)行研究，將熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用到了生物、食品等領(lǐng)域，尤其是在動(dòng)物檢疫方面，本文將具體闡述熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)及其在動(dòng)物檢疫中的應(yīng)用[2]。

1 熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介

熒光定量PCR技術(shù)是將熒光基團(tuán)加入到PCR反應(yīng)體系中，并在實(shí)驗(yàn)過程中，通過對(duì)熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)的進(jìn)程[3]。最后，根據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知的模板進(jìn)行定量的分析。這一新的檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)的目的，比常規(guī)PCR技術(shù)的運(yùn)用更加廣泛，廣大科研人員需要重視這一檢測(cè)技術(shù)在動(dòng)物檢疫中的運(yùn)用，為動(dòng)物檢疫工作提供新的檢測(cè)思路和方法，為人們提供更加安全無害的食品。

目前，常見的熒光定量PCR技術(shù)有TapMan技術(shù)、Amplisensor技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)、LightCycler技術(shù)以及復(fù)合探針定量PCR技術(shù)。其中，TapMan技術(shù)被廣泛運(yùn)用到了基因的定量檢測(cè)中，在熒光定量PCR技術(shù)市場(chǎng)中占據(jù)著重要的位置，這項(xiàng)技術(shù)所運(yùn)用的原理是Tap酶的5'外切酶的活性。Amplisensor技術(shù)是基于復(fù)合探針技術(shù)的熒光定量PCR技術(shù)，這一技術(shù)增加了操作步驟，還可能會(huì)產(chǎn)生污染，具有一定的局限性。分子信標(biāo)技術(shù)建立的原理是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，可以對(duì)擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)，而且還能夠避免交叉污染。Lightcycler技術(shù)是Roche公司開發(fā)的一種新的熒光定量PCR技術(shù)，它需要合成兩個(gè)比較長(zhǎng)的探針，成本較高。復(fù)合探針定量PCR技術(shù)需要合成兩個(gè)探針，一個(gè)是熒光探針，另一個(gè)是淬滅探針。新型的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的成本較低，檢測(cè)比較快速，并且具有高效性，克服了LightCycler技術(shù)和分子信標(biāo)技術(shù)等技術(shù)中的不足之處，在原有基礎(chǔ)上進(jìn)行了創(chuàng)新，通過解決原有技術(shù)上的短板，成為一種更為先進(jìn)的技術(shù)。熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)相較于傳統(tǒng)PCR檢測(cè)方式具有非常廣泛的應(yīng)用前景。

2 熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)

與常規(guī)PCR技術(shù)相比，熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)能夠進(jìn)行定量分析，而且具有更強(qiáng)的靈敏性以及特異性，還有效解決了常規(guī)PCR技術(shù)污染性較大的問題。另外，熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)還具有能進(jìn)行多重反應(yīng)、準(zhǔn)確性較高等優(yōu)點(diǎn)[4]。這種全新的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)能夠在一定程度上取代傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)，保障人們身體健康安全。隨著生活水平的提高，人們?cè)谶x擇食品的時(shí)不僅關(guān)心價(jià)格，還更加注重安全。而肉類是人們生活中必不可缺的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)其相較于常規(guī)PCR技術(shù)有較大的進(jìn)步和顯著的優(yōu)勢(shì)，這一檢測(cè)技術(shù)在動(dòng)物檢疫領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛，并取得了明顯的成效。

3 熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用

在動(dòng)物檢疫工作中，其中一項(xiàng)工作是檢測(cè)金黃色葡萄球菌，但是傳統(tǒng)的生化檢測(cè)方法需要耗費(fèi)許多的時(shí)間，而且靈敏度也不高，不能達(dá)到快速檢測(cè)的目的。為了解決上述問題，科研人員運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行了快速檢測(cè)。如唐吉思等運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)了牛乳中金黃色葡萄球菌腸毒素A基因。在研究過程中，建立了金黃色葡萄球菌腸毒素A基因DNA的SYBR GreenⅠreal-time PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示這一檢測(cè)方法的特異性較好，為檢測(cè)牛乳中金黃色葡萄球菌提供了新的檢測(cè)方法。另外，熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)也可以用來檢測(cè)炭疽桿菌、大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌等多種細(xì)菌。如杜清春等運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)建立了一種快速檢測(cè)炭疽桿菌的方法，在炭疽桿菌感染初期篩查中可有效運(yùn)用。

熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)也可以用來檢測(cè)病毒，如豬瘟病毒、豬水皰病病毒、口蹄疫病毒等。如胡騎等為了建立一種可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)O型口蹄疫病毒的TaqMan熒光定量PCR方法，設(shè)計(jì)了特異性引物和TaqMan探針，并建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終結(jié)果顯示，這一檢測(cè)方法比傳統(tǒng)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)靈敏10倍以上，能夠更加快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出O型口蹄疫病毒。Hui-Hua Zheng等運(yùn)用熒光定量PCR同時(shí)檢測(cè)了豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒3型。結(jié)果表明，這一檢測(cè)方法的線性度、重復(fù)性和再現(xiàn)性都比較高，是檢測(cè)豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒3型的可靠方法。

4 結(jié)語(yǔ)

運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)開展動(dòng)物檢疫工作是非常有效的，科研人員需對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行深入的研究，并要將其廣泛運(yùn)用到動(dòng)物檢疫工作中，從而能夠確保食品的安全性[5]。熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)可提高食品安全水平，肉類是人們生活中的必需品，人們生活水平的提高也讓人們不僅重視價(jià)格，更重視食品安全和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。隨著互聯(lián)網(wǎng)信息時(shí)代的到來，任何細(xì)微的問題都可以通過信息得知并被不斷放大，而肉類的主要來源是各種家畜，動(dòng)物檢疫工作需要更加嚴(yán)謹(jǐn)，熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)可有效解決此問題，通過對(duì)傳統(tǒng)PCR檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)，保障肉類食品的安全，推動(dòng)食品行業(yè)穩(wěn)定發(fā)展。