偽狂犬病毒分子生物學(xué)檢測(cè)方法研究進(jìn)展

萬(wàn)娟

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

偽狂犬病(porcine pseudorabies, PR)又稱(chēng)奧耶斯基病，是由偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的可以導(dǎo)致豬、牛、羊等多種動(dòng)物死亡的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。其臨床癥狀為體溫升高、全身瘙癢、多器官功能衰竭、癱瘓等。雖然PRV 可以感染多種動(dòng)物，但是豬是其唯一的自然貯存宿主。幾乎所有階段的豬都可感染該病毒，該病嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織已將其列為法定報(bào)告?zhèn)魅静　?/p>

2011 年起我國(guó)各地開(kāi)始陸續(xù)在傳統(tǒng)疫苗免疫的豬場(chǎng)暴發(fā)PRV，說(shuō)明PRV 開(kāi)始出現(xiàn)了變異，而傳統(tǒng)疫苗對(duì)于變異株不能起到良好的免疫保護(hù)作用。在2018 年報(bào)道了一例關(guān)于PRV 感染人的事件說(shuō)明了該病毒已經(jīng)具有感染人類(lèi)的能力，能夠及時(shí)診斷出PRV 是控制PR 的前提。病毒分離鑒定是實(shí)驗(yàn)室診斷中最經(jīng)典可靠的診斷方法，但該方法過(guò)于繁瑣并且診斷所需時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不能滿(mǎn)足生產(chǎn)實(shí)際需求。在分子生物學(xué)方法方面，人們建立了q-PCR，減少了檢測(cè)所需時(shí)間，為了基層檢測(cè)需要，建立了不需要特殊儀器設(shè)備的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，近幾年，隨著納米PCR 方法的出現(xiàn)，人們又建立PRV 納米PCR 檢測(cè)方法顯著提高了反應(yīng)靈敏度，PCR-LFD 技術(shù)將PCR 與橫向流動(dòng)試紙條、核酸探針相結(jié)合，不僅增加了其特異性還消除了電泳對(duì)環(huán)境造成的污染。本文從PRV 的分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，以期為臨床快速診斷PRV 所用方法的選擇提供一定的依據(jù)。

1 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

1.1 熒光定量PCR

熒光定量PCR 在常規(guī)PCR 基礎(chǔ)上引入了熒光探針，從而提高特異性和敏感性，并且不需要進(jìn)行凝膠電泳從而降低了開(kāi)蓋點(diǎn)樣時(shí)的污染，可直接通過(guò)電腦觀(guān)察到實(shí)時(shí)結(jié)果大大降低檢測(cè)所需時(shí)間，在2 個(gè)小時(shí)左右就可以完成。徐黎輝等通過(guò)制備并純化PRV g E 蛋白單克隆抗體，成功建立了能夠快速檢測(cè)PRV 野毒的直接免疫熒光檢測(cè)方法。李曉菲等根據(jù)PRV g E 基因設(shè)計(jì)引物和探針建立了能夠區(qū)分野毒和疫苗毒的TaqMan 熒光定量檢測(cè)方法。李艷等根據(jù)PRV g E 基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和LNA-TaqMan 探針，建立了基于LNA-TaqMan探針的豬偽狂犬病毒野毒熒光定量PCR 檢測(cè)方法。TaqMan 熒光定量方法與常規(guī)PCR 相比其特異性高10～100 倍，不存在交叉污染且能夠?qū)怂徇M(jìn)行定量檢測(cè)，不需要進(jìn)行電泳這一步，縮短了檢測(cè)所需時(shí)間，但該方法加入了探針因此提高了檢測(cè)成本，并且需要特殊的設(shè)備才能觀(guān)察到反應(yīng)結(jié)果，故并不適合基層診斷PRV 使用。

1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（LAMP）是一種在恒定溫度下利用Bst DNA 聚合酶和內(nèi)外兩對(duì)引物對(duì)靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域進(jìn)行特異性識(shí)別，而后啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)產(chǎn)生啞鈴狀DNA，再以該DNA 為模板進(jìn)行延伸形成莖-環(huán)DNA 結(jié)構(gòu)的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單且特異性強(qiáng)、反應(yīng)所需時(shí)間短、對(duì)設(shè)備要求不高，目前在多種病原體的快速檢測(cè)中已經(jīng)開(kāi)始廣泛使用。陳珍金等根據(jù)PRV gB 基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了4 對(duì)特異性引物并篩選出特異性強(qiáng)的引物PRV-1，縮短了反應(yīng)時(shí)間，建立了能夠通用檢測(cè)PRV 的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。許宗麗等根據(jù)PRV gB 基因的保守序列設(shè)計(jì)了一套特異性引物建立了PRV LAMP 可視化檢測(cè)方法。

1.3 納米PCR 方法

PRV G+C 含量高達(dá)74%，引物的Tm 值很高，因此采用常規(guī)PCR 法可能會(huì)對(duì)敏感性產(chǎn)生影響。納米PCR 作為一種新型PCR，在普通PCR 的基礎(chǔ)上加入了1～100 納米的納米粒子，在反應(yīng)液中當(dāng)反應(yīng)體系溫度發(fā)生變化時(shí)形成納米流體從而提高升降溫的速度，提高了引物和模板配對(duì)的效率，由此減少了退火溫度對(duì)體系的影響。張悅勇等參照PRV gB 基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物建立納米PCR 方法擴(kuò)增出了338bp 的特異性目的片段。納米PCR 相比于普通PCR 來(lái)說(shuō)，由于有納米粒子的參與，因此其靈敏度顯著升高，特異性也提高許多，并且目前已有納米PCR 試劑盒的售賣(mài)。

1.4 PCR-LFD 技術(shù)

PCR-LFD 技術(shù)是將PCR 技術(shù)、核酸探針雜交技術(shù)與橫向流動(dòng)試紙條（lateral flow dipstick，LFD）三項(xiàng)技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用試紙條直接檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的技術(shù)，該方法不需要電泳從而減少了檢測(cè)所需時(shí)間，提高了工作效率，目前在口蹄疫病毒、結(jié)核分支桿菌等方面有報(bào)道。張莉等根據(jù)PRV g E 基因設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物和其相應(yīng)的探針，并將下游引物標(biāo)記熒光素、探針標(biāo)記生物素，建立了特異性檢測(cè)PRV 的PCR-LFD檢測(cè)方法。廖文軍等用純化的抗人紅細(xì)胞單鏈抗體-PRV g E 蛋白雙功能融合蛋白為檢測(cè)線(xiàn)和膠體金標(biāo)記物，以羊抗豬Ig G 作為質(zhì)控線(xiàn)，采用雙抗原夾心法制備了檢測(cè)PRV gE 抗體的雙抗原膠體金試紙條。隨后，王華俊等將單克隆抗體技術(shù)和熒光微球免疫層析技術(shù)相結(jié)合，制備PRV g E 抗原檢測(cè)試紙卡。該方法利用試紙條代替電泳避免了溴化乙錠等核酸染料對(duì)環(huán)境的污染，用試紙條檢測(cè)是否出現(xiàn)兩個(gè)條帶以此來(lái)判斷PCR 產(chǎn)物的陰陽(yáng)性，假陽(yáng)性時(shí)也不會(huì)有兩條條帶的產(chǎn)生，并且目前已有偽狂犬病毒PCR-LFD 檢測(cè)試劑盒的售賣(mài)。該試劑盒可用于進(jìn)出口檢疫、實(shí)驗(yàn)室、飼養(yǎng)場(chǎng)等的臨床樣品檢測(cè)。

2 小結(jié)

目前，我國(guó)大多數(shù)豬偽狂犬疫苗為基因缺失疫苗，而目前偽狂犬變異毒株大多數(shù)也為基因缺失株，使得野毒株的診斷變得更加困難。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前科學(xué)家們建立了許多PRV 分子生物學(xué)，如qPCR，雖然精確度更高且操作簡(jiǎn)單，但需要特定的設(shè)備和儀器，不適合臨床上使用；LAMP 是近幾年興起的一種方法，該方法由于對(duì)設(shè)備沒(méi)有很高的要求，因此可以廣泛應(yīng)用于基層且結(jié)果可以直接觀(guān)察到，節(jié)省了檢測(cè)所需時(shí)間，但該方法容易有假陽(yáng)性的出現(xiàn)；納米PCR 方法是一種新型技術(shù)，該方法由于有納米粒子的加入，特異性比普通PCR 提高了100 倍左右；橫向流動(dòng)試紙條不需要電泳減少了污染，且特異性和靈敏度與PCR 法相比，由于自身設(shè)備條件的不同因此選擇的方法也不同。相信隨著科學(xué)家們研究的不斷深入，將會(huì)有更好的檢測(cè)PRV 的方法，從而為PR 的診斷和防控提供更加良好的條件和保障。