葛花總黃酮通過Nrf2/HO-1信號通路對1型糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用

羅 影， 左中夫， 程 雪， 張 俏， 劉 暢， 閔連秋

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科一病區(qū)，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001；3.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科三病區(qū)，遼寧 錦州 121001)

糖尿病腎病人群逐年增加[1]，其主要致病因素為高血糖、高血壓和膽固醇水平[2]。氧化應(yīng)激為機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)失衡，為糖尿病腎病的重要發(fā)病機(jī)制之一。因此，控制血糖水平及抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)對防治糖尿病腎病尤為重要[3-5]。核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid-2-related factor-2, Nrf2)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，Nrf2對調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激所引發(fā)的細(xì)胞損傷修復(fù)過程尤為重要[5-6]。過量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)會導(dǎo)致Nrf2/Kelch樣ECH相關(guān)蛋白-1(Keap1)復(fù)合物的破壞，進(jìn)而與Keapl解耦聯(lián)，調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化應(yīng)激失衡[7]。Nrf2的激活會上調(diào)其下游關(guān)鍵的抗氧化酶血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)的表達(dá)，進(jìn)而拮抗體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]。

隨著中醫(yī)藥的發(fā)揚光大，天然中藥提取物在治療糖尿病腎病中扮演重要的角色[9-10]。葛花為傳統(tǒng)中藥，又名葛條花，可清熱消渴。葛花總黃酮為葛花的有效活性成分之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，葛花總黃酮能降低血糖并發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化功能[11]。研究發(fā)現(xiàn)，葛花總黃酮可有效降低1型糖尿病(T1DM)小鼠血糖及清除氧自由基，緩解糖尿病導(dǎo)致的認(rèn)知功能損傷[12]。然而，葛花總黃酮對T1DM大鼠腎臟的影響尚不清楚。本研究通過鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)制備T1DM模型，從氧化應(yīng)激方面考慮葛花總黃酮對T1DM大鼠腎臟的緩解作用，為糖尿病腎病的防治提供新的可能藥物。

1 材料

1.1 動物 健康雄性SD大鼠60只，購自錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(遼)2009-2017，體質(zhì)量180～220 g。實驗操作遵循國家《實驗動物管理條例》。

1.2 試劑 鹽酸二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號02000913，0.5 g/片)；葛花總黃酮(由錦州醫(yī)科大學(xué)化學(xué)實驗室提供，純度大于85%)，溶于蒸餾水中配成所需要質(zhì)量濃度。STZ(美國Sigma公司)；兔抗大鼠Nrf2、兔抗大鼠HO-1、小鼠抗大鼠β-actin(英國Abcam公司)；HE染色試劑盒、熒光二抗、Western blot二抗(上海碧云天生物科技有限公司)；MDA、SOD檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；石蠟切片機(jī)(德國SLEE公司)；水平電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 SD大鼠穩(wěn)定2周后按55 mg/kg劑量腹腔一次性注射STZ，72 h后尾靜脈采血測血糖，將血糖濃度大于16.7 mmol/L者定為1型糖尿病大鼠模型，隨機(jī)分成5組，分別為模型組，葛花總黃酮低劑量組(50 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)、高劑量組(200 mg/kg)，二甲雙胍組(75 mg/kg)，另取10只正常大鼠作為正常對照組，成模1周后灌胃給藥，每天1次，劑量依據(jù)文獻(xiàn)[12-13]及本課題組預(yù)實驗。

2.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)測定 實驗過程中檢測大鼠空腹血糖，處死前取血離心，分離得到的血清在-20 ℃下凍存，待測Scr、BUN水平。12周后，每組取5只大鼠，固定后處死，取出腎臟，石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染免疫組織化學(xué)染色；另各組取5只大鼠腎臟，依據(jù)質(zhì)量加蛋白裂解液，冰上剪碎，在4 ℃下離心25 min后取上清，-20 ℃保存用于Western blot檢測。

2.3 血清指標(biāo)檢測 空腹血糖、Scr、BUN水平檢測采用全自動生化分析儀，MDA水平、SOD活性檢測采用ELISA試劑盒，具體步驟按照相關(guān)說明書執(zhí)行。

2.4 HE染色 固定石蠟包埋制備的切片脫蠟后，PBS洗3次，蘇木素浸染2 min，自來水沖洗，伊紅浸染1 min，自來水沖洗，脫水透明后封片，拍照觀察。

2.5 大鼠腎臟Nrf2表達(dá)檢測 固定石蠟包埋制備的切片脫蠟后，PBS洗3次，加入3%H2O2，在室溫下靜置12 min，PBS洗3次，每次3 min，3%山羊血清室溫孵育30 min，不洗，滴加兔抗大鼠Nrf2(1∶600)，在4 ℃下過夜，PBS洗3次，每次3 min。滴加二抗，在室溫下靜置30 min，PBS洗3次，每次3 min，滴加SABC試劑，在室溫下靜置30 min，PBS洗3次，每次3 min，DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明封片后在200倍視野下每張切片隨機(jī)挑選6個部位拍照，以棕黃色為判斷陽性表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用Image J軟件分析同視野下陽性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的比值，作為Nrf2表達(dá)陽性率。

2.6 大鼠腎臟Nrf2、HO-1相對表達(dá)檢測 采用BCA法檢測蛋白濃度，電泳時加入15 μL樣品，在120 V下電泳，轉(zhuǎn)膜后1% BSA封閉2 h，加入一抗(Nrf2，1∶8 000；HO-1，1∶10 000)，在4 ℃下孵育過夜，TBST洗4次，每次5 min，加入二抗室溫2 h，TBST洗4次，每次5 min，ECL顯影，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析灰度值。

3 結(jié)果

3.1 葛花總黃酮對大鼠血糖的影響 治療后，與正常對照組比較，模型組大鼠血糖升高(P<0.01);與模型組比較，葛花總黃酮各劑量組及二甲雙胍組大鼠血糖降低(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性，以100、200 mg/kg劑量作用更明顯，見表1。

表1 葛花總黃酮對大鼠血糖的影響

3.2 葛花總黃酮對大鼠Scr、BUN水平的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠Scr、BUN水平升高(P<0.01)；與模型組比較，葛花總黃酮各劑量組及二甲雙胍組大鼠Scr、BUN水平降低(P<0.05，P<0.01)，以100、200 mg/kg劑量作用更明顯，見表2。

表2 葛花總黃酮對大鼠Scr、BUN水平的影響

3.3 葛花總黃酮對大鼠腎臟病理學(xué)的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠腎小球體積增大，細(xì)胞外基質(zhì)增生，并可見腎小管上皮細(xì)胞水腫；與模型組比較，葛花總黃酮100、200 mg/kg組及二甲雙胍組上述情況有所改善，見圖1。

圖1 葛花總黃酮對大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色，×400)

3.4 葛花總黃酮對大鼠氧化應(yīng)激的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清MDA水平升高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.01)；與模型組比較，葛花總黃酮各劑量組及二甲雙胍組大鼠MDA水平降低(P<0.05，P<0.01)，SOD活性增加(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 葛花總黃酮對大鼠氧化應(yīng)激的影響

3.5 葛花總黃酮對大鼠腎組織Nrf2表達(dá)的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織Nrf2表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，葛花總黃酮100、200 mg/kg組大鼠腎組織Nrf2表達(dá)升高(P<0.01)，見圖2、表4。

圖2 各組大鼠腎臟組織Nrf2表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

3.6 葛花總黃酮對大鼠腎組織Nrf2、HO-1表達(dá)的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織Nrf2表達(dá)升高(P<0.01)，HO-1表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，葛花總黃酮100、200 mg/kg組Nrf2、HO-1表達(dá)均升高(P<0.01)，見圖3、表4。

表4 葛花總黃酮對大鼠腎組織Nrf2、HO-1表達(dá)的影響

注：A為正常對照組，B為模型組，C為葛花總黃酮50 mg/kg組，D為葛花總黃酮100 mg/kg組，E為葛花總黃酮200 mg/kg組，F(xiàn)為二甲雙胍75 mg/kg組。

4 討論

預(yù)計至2025年，全球糖尿病人群將高達(dá)3億[14]。糖尿病腎病為糖尿病常見并發(fā)癥，會引起腎結(jié)構(gòu)異常，如系膜擴(kuò)張、腎小球硬化、氧化應(yīng)激和炎癥失衡等[15]，為腎功能不全患者致病的重要原因[16]。因此，探索一種更安全的治療糖尿病腎病的藥物尤為重要。糖尿病腎病狀態(tài)下，高糖血癥、炎癥因子等可引起活性氧族(ROS)堆積，進(jìn)而加重糖尿病腎病[17]，而外源性給予抗氧化應(yīng)激藥物可對糖尿病腎病產(chǎn)生保護(hù)作用及減緩糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展[6, 18]。在本實驗中，發(fā)現(xiàn)葛花總黃酮100、200 mg/kg組及二甲雙胍75 mg/kg組可降低T1DM大鼠血糖、血肌酐和血尿素氮水平，同時HE染色顯示大鼠腎組織損傷程度明顯減輕，以上結(jié)果提示，本實驗設(shè)計合理，動物模型穩(wěn)定，能夠驗證葛花總黃酮對T1DM大鼠的預(yù)防保護(hù)作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2信號通路對包括糖尿病腎病在內(nèi)的多種以氧化應(yīng)激為主要發(fā)病機(jī)制的疾病都具有保護(hù)作用。因此，在糖尿病腎病中通過誘導(dǎo)Nrf2治療的理論是有說服力的，動物研究明確支持這種方法的有效性[19]。許多研究表明，Nrf2激活劑，無論是合成的還是天然的，都能在糖尿病和小鼠模型中提供腎臟保護(hù)，改善蛋白尿、腎氧化損傷、炎癥、基質(zhì)沉積、纖維化和組織病理學(xué)損傷[20-22]。一些Nrf2激動劑也存在于一些傳統(tǒng)上與腎臟健康相關(guān)的中藥制劑、茶葉和東方食物來源中[23-24]。Mittal等[25]證實，激活Nrf2通路后可減輕糖尿病小鼠腎功能不全及氧化應(yīng)激水平。本研究發(fā)現(xiàn)，T1DM大鼠腎臟Nrf2表達(dá)有所增加，這可能為腎臟對抗氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，然而HO-1表達(dá)卻降低，這可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)過度消耗了自身Nrf2/HO-1通路激活而上調(diào)的HO-1，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激損傷。而給予葛花總黃酮治療后，葛花總黃酮100、200 mg/kg組抗氧化能力增加，MDA水平降低，SOD活性增加，同時大鼠腎臟Nrf2、HO-1表達(dá)增加，提示葛花總黃酮在一定程度上可以激活Nrf2的表達(dá)，上調(diào)HO-1的表達(dá)，進(jìn)而對抗T1DM大鼠腎臟損傷。本研究中，二甲雙胍對Nrf2/HO-1通路的調(diào)節(jié)作用并不明顯，這可能由于二甲雙胍并不通過該通路調(diào)節(jié)T1DM大鼠腎臟損傷，而主要通過調(diào)節(jié)腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase, AMPK)、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶(phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase, p-p38MAPK)等通路對發(fā)揮防治糖尿病腎病的作用[26]。

綜上所述，葛花總黃酮可通過降低T1DM大鼠血糖、血肌酐和血尿素氮水平，增強(qiáng)大鼠抗氧化能力進(jìn)而緩解T1DM大鼠腎臟損傷，其機(jī)制可能與降低血糖和激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)。當(dāng)然，T1DM發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，葛花總黃酮對調(diào)控此信號通路進(jìn)而對T1DM大鼠腎臟損傷的防治效果有待進(jìn)一步深入探討。