厭氧氨氧化工藝處理不同抗生素廢水的性能比較

張肖靜，馬冰冰，張涵，位登輝，張紅麗，胡浩，趙子睿

（鄭州輕工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，河南鄭州450001）

引 言

厭氧氨氧化是一種新型脫氮工藝，與亞硝化工藝結(jié)合可以在不消耗有機(jī)碳源的條件下實(shí)現(xiàn)自養(yǎng)脫氮，相比傳統(tǒng)的硝化-反硝化工藝能夠節(jié)省63%的曝氣能耗，而節(jié)省下來(lái)的有機(jī)物可以轉(zhuǎn)化為能源性氣體甲烷，符合可持續(xù)污水處理的要求[1-3]。厭氧氨氧化工藝的功能微生物是厭氧氨氧化菌（anaerobic ammonium-oxidizing bacteria, AAOB），該類細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢、難以富集，且對(duì)環(huán)境條件非常敏感，限制了該工藝的發(fā)展及應(yīng)用[4]。

我國(guó)是抗生素生產(chǎn)和使用大國(guó)，各級(jí)醫(yī)院住院患者抗生素使用率超過(guò)70%，遠(yuǎn)高于世界衛(wèi)生組織所推薦的使用率（30%），尤其是磺胺類和四環(huán)素類的抗生素，近年來(lái)其使用量大幅度增加?？股氐拇罅渴褂脤?dǎo)致其不可避免地進(jìn)入人類生活的環(huán)境，據(jù)報(bào)道，目前已經(jīng)在淡水、土壤、污水廠等環(huán)境中檢測(cè)到了抗生素的存在[5-9]。在這兩類抗生素中，以磺胺甲唑（SMX）和土霉素（OTC）為代表，其使用最為廣泛，在多種環(huán)境中被頻繁檢出。例如，在城市污水廠中檢測(cè)到了3 μg/L 的SMX[10]，在家禽養(yǎng)殖廢水中檢測(cè)到了0～2.3 mg/L 的SMX[11]，而在城市污水廠二沉池出水中SMX 濃度則為115～534 ng/L[12]。同樣，OTC 也在類似環(huán)境中被檢測(cè)到，濃度從0.07 ng/L～19.55 mg/L 不等[13-16]。更為重要的是，已有多項(xiàng)研究表明，抗生素對(duì)多種污水處理工藝表現(xiàn)出明顯抑制作用，包括硝化反硝化工藝、厭氧氨氧化自養(yǎng)脫氮工藝等[17-19]。例如，Wang 等[20]的研究表明，抗生素的加入降低了微生物群落的多樣性和反硝化菌屬的豐度。Zhang 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)OTC 濃度為40 mg/L 時(shí)，厭氧氨氧化菌的相對(duì)豐度從16.40%下降到9.35%。當(dāng)OTC 濃度大于40 mg/L 時(shí)，部分微生物死亡，厭氧氨氧化菌的相對(duì)豐度下降到4.6%。厭氧氨氧化作為一種最具發(fā)展前景的脫氮工藝，同時(shí)也是可持續(xù)污水處理系統(tǒng)的重要組成單元，明確抗生素對(duì)其影響機(jī)制對(duì)于該工藝的發(fā)展應(yīng)用至關(guān)重要[22]。

因此，本文針對(duì)應(yīng)用較為廣泛的SMX 和OTC 兩種抗生素，分別考察了其在不同濃度、不同暴露時(shí)間下對(duì)厭氧氨氧化生物膜活性、胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）分泌及功能微生物演替的影響規(guī)律，考慮到SMX 和OTC 在多種環(huán)境中的濃度范圍[15,23]，選擇1～1000 μg/L 的抗生素為本文的研究對(duì)象，并重點(diǎn)對(duì)兩種抗生素的不同作用進(jìn)行了對(duì)比，以期為厭氧氨氧化處理含抗生素廢水或者應(yīng)用于有抗生素暴露風(fēng)險(xiǎn)的污水處理領(lǐng)域提供一些理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用兩個(gè)相同的厭氧氨氧化濾柱，標(biāo)為1#和2#。濾柱有效體積為2 L，由底部進(jìn)水，頂部出水，連續(xù)運(yùn)行。濾柱內(nèi)部以火山巖為填料，火山巖粒徑為6～8 mm，采用人工配水，配水包括50 mg/L 的氨氮，50 mg/L 的亞氮，1000 mg/L的堿度，分別以（NH4）2SO4、NaNO2、NaHCO3配制，同時(shí)加以CaCl2、KH2PO4、MgSO4，以及1 ml/L 的微量元素，進(jìn)水pH 為7.8 左右，HRT 為4 h。將兩個(gè)厭氧氨氧化濾柱中的生物膜分別在不同濃度（1、10、100、1000 μg/L）的抗生素中短期暴露（6 h）和長(zhǎng)期暴露（22 d）后，測(cè)定其微生物活性、EPS和微生物組成。

1.2 活性測(cè)定序批實(shí)驗(yàn)

首先，在沒(méi)有接觸抗生素時(shí)測(cè)定兩個(gè)生物濾柱中生物膜的活性，作為空白對(duì)照。之后依次在不同濃度的抗生素中分別暴露6 h 和22 d 后，再分別測(cè)定活性。具體方法為：從火山巖填料上取下約10 mg生物膜，置于10 ml離心管中，采用實(shí)驗(yàn)用水清洗三次之后，再次加入實(shí)驗(yàn)用水至10 ml，放置于恒溫振蕩床上。反應(yīng)溫度為25 ℃，pH 為8.0，反應(yīng)時(shí)間為6 h，將反應(yīng)始末的水樣取出測(cè)定氨氮、亞氮和硝氮，根據(jù)式（1）計(jì)算厭氧氨氧化活性（SAA）。三個(gè)離心管同時(shí)測(cè)定，取平均值。

1.3 EPS和溶解性微生物產(chǎn)物的測(cè)定

EPS 提取過(guò)程如下[24]：首先取5 ml 生物膜樣品于8000 r/min 離心15 min，取上清液保存待測(cè)溶解性微生物產(chǎn)物(SMP)；離心沉淀在磷酸緩沖溶液中再懸浮，40 kHz 超聲處理3 min；混合物在80 ℃水浴中加熱30 min，每10 min 搖勻一次；懸浮液8000 r/min離心15 min，收集上清液進(jìn)行EPS測(cè)定，剩余物質(zhì)測(cè)定污泥質(zhì)量。用Folin-phenol 法在500 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定提取液中的蛋白質(zhì)（PRO），用蒽酮法在625 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定提取液中的多糖（PS）。

1.4 分析方法

氨氮采用納氏試劑分光光度法在410 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定，亞氮采用N-1-萘基乙二胺分光光度法在波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)定，硝氮采用紫外分光光度法在220和275 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定，pH、DO 和溫度采用WTW 多參數(shù)測(cè)定儀測(cè)定。

1.5 高通量測(cè)序

長(zhǎng)期暴露在不同濃度的抗生素中后，取生物膜樣品進(jìn)行高通量測(cè)序分析。采用通用引物338F/806R 對(duì)16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，利用Illumin公司的Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類分析。將每條序列與Silva數(shù)據(jù)庫(kù)（SSU132）進(jìn)行比對(duì)，得到物種分類。分析計(jì)算Shannon、Simpson、ACE、Chao1等多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗生素短期和長(zhǎng)期暴露對(duì)厭氧氨氧化活性的影響

厭氧氨氧化生物膜分別在不同濃度的兩種抗生素中暴露6 h 和22 d 之后的SAA 如圖1 所示。1#生物膜未暴露在OTC 抗生素中時(shí)，其SAA 為14.6 mg/(h·g SS)，而在1 μg/L 的OTC 中暴露6 h 后，再次測(cè)定其SAA 為14.5 mg/(h·g SS)，該結(jié)果與未暴露在OTC 中的SAA 相比變化不大，說(shuō)明1 μg/L 的OTC 對(duì)厭氧氨氧化生物膜的短期影響不大。在10、100、1000 μg/L的OTC中短期暴露后，SAA隨著OTC濃度的增加，逐漸降低為12.2、12.0 和11.6 mg/(h·g SS)。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明10 μg/L 的OTC 短期作用對(duì)厭氧氨氧化生物膜造成了嚴(yán)重的抑制（p＜0.05），而在此基礎(chǔ)上繼續(xù)增加抗生素濃度，雖然依然有抑制，但抑制程度沒(méi)有進(jìn)一步加強(qiáng)。由此可知，OTC 對(duì)厭氧氨氧化短期抑制的閾值為10 μg/L。

圖1 在不同抗生素中暴露不同時(shí)間后的厭氧氨氧化活性Fig.1 Anammox activity after exposure to different antibiotics for different time

1#厭氧氨氧化濾柱的生物膜長(zhǎng)期暴露在1 μg/L的OTC 中22 d 之后，測(cè)定其SAA 為14.5 mg/(h·g SS)，這與短期暴露后的SAA 相同，說(shuō)明1 μg/L 的OTC 對(duì)厭氧氨氧化生物膜的短期作用和長(zhǎng)期作用規(guī)律是一致的，均對(duì)微生物活性影響不大。而長(zhǎng)期暴露在10 μg/L 的OTC 之后，同樣對(duì)厭氧氨氧化生物膜表現(xiàn)出了抑制，SAA 降低為13.3 mg/(h·g SS)。值得注意的是，該值高于短期作用后的SAA，推測(cè)是在長(zhǎng)期暴露過(guò)程中，厭氧氨氧化生物膜對(duì)OTC 逐漸有了適應(yīng)性，因而生物活性表現(xiàn)出一定的耐受能力。而進(jìn)一步在100 μg/L 的OTC 中長(zhǎng)期暴露后，SAA 不僅沒(méi)有降低，反而升高到了15.1 mg/(h·g SS)。這與短期暴露的結(jié)果是不同的，該結(jié)果進(jìn)一步證明了厭氧氨氧化生物膜長(zhǎng)期暴露在OTC 中后表現(xiàn)出了適應(yīng)性，這也可通過(guò)2.4 節(jié)的微生物豐度的增加進(jìn)一步證明。有研究表明，微生物在長(zhǎng)期接觸抗生素后可促進(jìn)抗性基因的富集，通過(guò)誘導(dǎo)抗性基因進(jìn)而對(duì)其表現(xiàn)出適應(yīng)性[25-26]。然而，在OTC 增加到1000 μg/L 之后，長(zhǎng)期暴露后的SAA 顯著下降，降低到11.1 mg/(h·g SS)（p＜0.05）。這說(shuō)明此時(shí)達(dá)到了OTC的抑制閾值，長(zhǎng)期抑制閾值為1000 μg/L。

2#厭氧氨氧化濾柱的生物膜在SMX 中短期暴露之前，SAA 為14.5 mg/(h·g SS)，而在1 μg/L 中短期暴露后，SAA 輕微降低為14.3 mg/(h·g SS)，之后在10、100、1000 μg/L 中短期暴露后，SAA 分別降低為13.8、13.7 和13.1 mg/(h·g SS)。在濃度1～1000 μg/L范圍內(nèi)，雖然隨著SMX 的增加，SAA 呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢(shì)，但整體降低不夠顯著，這說(shuō)明厭氧氨氧化生物膜對(duì)SMX的抵抗性較強(qiáng)。長(zhǎng)期暴露在1、10、100、1000 μg/L 的SMX 中后，SAA 分別變化為14.8、14.3、14.1 和13.6 mg/(h·g SS)。1 μg/L 的SMX 導(dǎo)致SAA 輕微增加，由于短期并未產(chǎn)生明顯抑制，因此可能并不存在先抑制后適應(yīng)的過(guò)程。有文獻(xiàn)報(bào)道，低濃度的有機(jī)物有助于厭氧氨氧化的高效穩(wěn)定運(yùn)行[27]。此外，也有研究表明，低濃度的抗生素不會(huì)影響脫氮性能和微生物的活性[28]。因此，這一方面有可能是厭氧氨氧化生物膜對(duì)SMX 有較好的抗性，另一方面可能是SMX 誘導(dǎo)了反硝化來(lái)提高脫氮性能，該結(jié)果同樣可通過(guò)微生物結(jié)果來(lái)證明。在隨后增加SMX 濃度后，厭氧氨氧化生物膜活性在長(zhǎng)期暴露后均表現(xiàn)出輕微的降低，不同濃度下其SAA 的降低程度與短期暴露后相差不大。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明無(wú)論是短期作用還是長(zhǎng)期作用，1～1000 μg/L 的SMX 對(duì)厭氧氨氧化均表現(xiàn)出較小的影響，未帶來(lái)明顯的抑制。

2.2 抗生素對(duì)胞外聚合物的影響

EPS 是微生物自身分泌并釋放到胞外的聚合物，在抵抗毒性抑制、承受環(huán)境壓力等方面起著重要作用。EPS 的主要成分與微生物細(xì)胞非常相似，主要包括PRO和PS兩大類，其主要作用是幫助細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)抵御殺菌劑和有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的危害。

從圖2 可知，1#反應(yīng)器的生物膜在1 μg/L 的OTC 中長(zhǎng)期暴露后，微生物響應(yīng)較慢，分泌較少的EPS，且蛋白質(zhì)和多糖均顯著下降，這說(shuō)明微生物在該環(huán)境下能夠正常生長(zhǎng)，處于穩(wěn)定生長(zhǎng)階段。而在OTC 增加到10 μg/L 以后，EPS 大量增加，尤其是蛋白質(zhì)的變化，從32.6 mg/gSS增加到85.49 mg/gSS，這是微生物受到毒性抑制的表現(xiàn)[29]。當(dāng)微生物接觸抗生素后，往往會(huì)分泌更多的EPS[30-31]。之后隨著OTC濃度的增加，EPS的量再次顯著增加，說(shuō)明微生物通過(guò)分泌大量的EPS 而逐漸適應(yīng)OTC，其活性逐漸得到恢復(fù)。在濃度增加至1000 μg/L時(shí)，微生物受到嚴(yán)重抑制，大量微生物死亡，其分泌的EPS 也逐漸減少。但值得注意的是，隨著OTC 濃度的增加，SMP的含量逐漸上升，說(shuō)明有一部分死亡的微生物產(chǎn)物溶解在生物膜中，這部分SMP 被微生物利用進(jìn)行反硝化，反倒提高了微生物的活性。另外，PRO/PS 的值也逐漸下降，說(shuō)明分泌的PS 逐漸增多，這也是微生物應(yīng)對(duì)毒性的表現(xiàn)。

圖2 在不同抗生素中長(zhǎng)期暴露后的EPS和SMP結(jié)果Fig.2 EPS and SMP results after long-term exposure to different antibiotics

在2#反應(yīng)器中，微生物快速響應(yīng)，EPS 在1 μg/L的SMX中即輕微增加，之后則隨著SMX濃度的增高而顯著增加，這說(shuō)明厭氧氨氧化生物膜對(duì)SMX 的響應(yīng)較快，低濃度的SMX 即可刺激EPS 分泌量增加，從而保護(hù)厭氧氨氧化微生物免受有毒物質(zhì)的抑制。因而在長(zhǎng)期作用過(guò)程中，SMX 對(duì)SAA 的影響不大。但值得注意的是，SMP 中PRO/PS 的值一直降低，這可能是厭氧氨氧化菌應(yīng)對(duì)SMX 的一種策略，通過(guò)分泌更多的溶解性多糖，來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受傷害，該結(jié)果與OTC 的結(jié)果一致。Wang 等[32]將兩個(gè)反應(yīng)器中SMX濃度均控制為1 mg/L，在有EPS保護(hù)的情況下，微生物的OUR 值在145 h 后降為95 mg/(L·h)；而在沒(méi)有EPS 保護(hù)的情況下，微生物的OUR 值則降至10 mg/(L·h)以下。由此可知，微生物接觸SMX 后能夠快速分泌較多的EPS以抵抗毒性抑制。

2.3 優(yōu)勢(shì)OTU和微生物多樣性變化

將暴露在不同濃度抗生素的生物膜測(cè)序后，得到的多樣性指數(shù)如表1所示。1#濾柱中，Shannon指數(shù)隨著OTC 濃度的增高逐漸增大，說(shuō)明OTC 的引入帶來(lái)了新的微生物種群，使得微生物多樣性增加，也間接說(shuō)明了此時(shí)AAOB 受到其他微生物的影響。然而值得注意的是，在OTC 為100 μg/L 時(shí)，Shannon指數(shù)大幅度下降，而此時(shí)SAA增加，說(shuō)明此時(shí)AAOB逐漸適應(yīng)了OTC 的存在，活性恢復(fù)，而其他微生物則由于AAOB 的恢復(fù)而降低了活性及增殖，因而表現(xiàn)為多樣性降低。然而在OTC 增加到1000 μg/L 之后，Shannon 指數(shù)再次增加，此時(shí)AAOB 再次受到抑制，活性與豐度均下降，其他微生物得以生長(zhǎng)，反應(yīng)器的性能與生物多樣性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。2#濾柱中，隨著SMX 濃度的增加，Shannon 指數(shù)逐漸上升后趨于穩(wěn)定，這說(shuō)明生物膜內(nèi)微生物多樣性上升，同時(shí)ACE 指數(shù)逐漸增加，說(shuō)明優(yōu)勢(shì)微生物的豐度在上升。這是因?yàn)镾MX 已經(jīng)成功誘導(dǎo)了反硝化菌，并與厭氧氨氧化耦合，因而整個(gè)過(guò)程系統(tǒng)比較穩(wěn)定。Simpson 指數(shù)與Shannon 指數(shù)的變化趨勢(shì)剛好相反，反映的規(guī)律一致。

表1 不同生物膜樣品的多樣性指數(shù)和主要功能微生物的相對(duì)豐度Table 1 The diversity index of different biofilm samples and the relative abundance of main functional microorganisms

ACE和Chao1指數(shù)分別用來(lái)反映優(yōu)勢(shì)OTU的豐富度和個(gè)數(shù)，其變化規(guī)律基本一致，同樣反映出厭氧氨氧化濾柱在暴露于抗生素后物種種類和豐富度的增加。優(yōu)勢(shì)OTU（相對(duì)比例＞1%）共分布在七個(gè)不同的門，分別是：Planctomycetes、Proteobacteria、Gemmatimonadetes、Petiscibacteria、Acidobacteria、Armatimonadetes 和Deinococcus-Thermus，其生物學(xué)分類及相對(duì)豐度見(jiàn)表2和圖3。在這七個(gè)門中，相對(duì)豐度最高的是Planctomycetes 門，只包含一個(gè)OTU，但相對(duì)比例達(dá)到了17.98%，說(shuō)明其在厭氧氨氧化生物膜內(nèi)占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。厭氧氨氧化菌屬于Planctomycetes 門，這也證明了即使在長(zhǎng)期暴露于抗生素的環(huán)境下，反應(yīng)器依然是以厭氧氨氧化為主的反應(yīng)系統(tǒng)，完成了大部分的脫氮過(guò)程。而Proteobacteria 門含有6 個(gè)OTU 種類，其中5 個(gè)屬于Beta-Proteobacteria， 包括了 Nitrosomonas、Denitritisomas、Acidovorax 等主要的種群。另外幾個(gè)門均只包含一個(gè)OTU，相對(duì)比例較低，再次證明Planctomycetes 和Proteobacteria 在厭氧氨氧化系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)地位，這和之前的研究結(jié)果是一致的[33-34]，Beta-proteobacteria 是處理抗生素廢水反應(yīng)器中的主要優(yōu)勢(shì)微生物[35]。值得注意的是，在1#生物膜中，除了OTU1 之外，其他OTU 均是在未添加OTC 時(shí)最高，之后隨著暴露在OTC 中，其豐度明顯下降。OTU1對(duì)應(yīng)的種屬為Candidatus，屬于AAOB菌，這個(gè)結(jié)果證明在加入OTC 后，厭氧氨氧化系統(tǒng)發(fā)生了明顯的改變，生物多樣性增加，原有的優(yōu)勢(shì)微生物受到抑制，比例下降。而2#生物膜則相反，優(yōu)勢(shì)OTU的相對(duì)豐度在此后的幾個(gè)階段均有所增加，說(shuō)明其多樣性改變不大，優(yōu)勢(shì)微生物沒(méi)有發(fā)生改變。這個(gè)結(jié)果再次說(shuō)明了OTC 和SMX 對(duì)厭氧氨氧化生物膜作用的不同。

圖3 OTU分類結(jié)果Fig.3 OTU classification results

表2 優(yōu)勢(shì)OTU（＞1%）的生物學(xué)分類及相對(duì)豐度Table 2 The taxonomic results and relative abundances of the dominated OTU（＞1%）

2.4 脫氮功能微生物的豐度變化

經(jīng)過(guò)與Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到不同水平的生物分類。在門分類水平上，Proteobacteria 在兩個(gè)濾柱不同階段的所有生物膜中相對(duì)豐度均為最大，在1#濾柱的不同階段分別為57.8%、28.5%、41.3%、31.6%、41.1%、在2#濾柱的不同階段分別為31.5%、52.3%、55.9%、51.4%、51.1%。雖然1#生物膜在剛接觸OTC 時(shí)，Proteobacteria 豐度急劇減少了29.3%，但隨后能夠逐漸恢復(fù)，并始終保持優(yōu)勢(shì)地位。而2#生物膜接觸SMX 后，Proteobacteria 的豐度不僅沒(méi)有下降，反而顯著增加，并在不同濃度下保持穩(wěn)定，這也間接反映了2#生物膜在接觸SMX 后的穩(wěn)定性。相對(duì)豐度較高的門其次為Planctomycetes，在不同階段分別為19.0%、25.7%、12.3%、41.5%、20.7% 和15.0%、23.5%、17.2%、16.4%、12.6%。多篇文獻(xiàn)報(bào)道，這兩個(gè)門的微生物廣泛存在于自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)[33-34]。生物膜接觸SMX 后，Proteobacteria 的增多有可能使其獲得抗生素耐藥性。關(guān)于抗生素的抵抗機(jī)理主要包括誘導(dǎo)可以編碼抗生素改性或者失活的酶，誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞中抗生素靶點(diǎn)的突變，以及位于細(xì)菌細(xì)胞膜上的泵排出機(jī)制等[36-37]?？紤]到厭氧氨氧化對(duì)OTC 的自我適應(yīng)，其對(duì)于OTC 的抵抗作用有可能是由于泵出機(jī)制，而對(duì)SMX 則可能是由于降解作用。

屬水平的微生物分類結(jié)果表明，長(zhǎng)期暴露在不同濃度不同種類的抗生素中后，厭氧氨氧化生物膜的微生物組成發(fā)生了較大的屬轉(zhuǎn)移。厭氧氨氧化的功能微生物為AAOB，結(jié)合圖4 和表1 可知，屬于AAOB 功能菌的CandidatusKuenenia是1#生物膜中的優(yōu)勢(shì)微生物，其相對(duì)豐度在不同OTC 濃度下表現(xiàn)出較大的波動(dòng)，最初接觸OTC 時(shí)對(duì)AAOB 有刺激強(qiáng)化作用，AAOB 的相對(duì)豐度從16.4%增加到23.4%，在OTC 濃度增加為10 μg/L 之后又受到抑制，并在100 μg/L OTC時(shí)增強(qiáng)，而在1000 μg/L OTC時(shí)再次受到抑制，這與微生物活性的測(cè)定結(jié)果表現(xiàn)出良好的正相關(guān)。而在不同濃度的SMX 中暴露的生物膜相對(duì)豐度分別為13.85%、20.19%、14.31%、14.15%和9.43%，表現(xiàn)出先增大再減小的趨勢(shì)。這說(shuō)明AAOB對(duì)抗生素的響應(yīng)均為：先刺激增強(qiáng)再被抑制。值得注意的是，在接觸抗生素后，兩個(gè)反應(yīng)器中均誘導(dǎo)出反硝化菌Denitritisoma，且表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。1#濾柱中，OTC 對(duì)反硝化菌的誘導(dǎo)較慢，僅在OTC達(dá)到1000 μg/L時(shí)表現(xiàn)出明顯的增殖，相對(duì)豐度從0.14%增加到4.2%，而此時(shí)AAOB已經(jīng)受到抑制，反硝化菌Denitritisoma的增加有可能是在長(zhǎng)期抑制下微生物死亡殘?bào)w的分解提供了有機(jī)質(zhì)，促進(jìn)了反硝化反應(yīng)的發(fā)生。不同的是，在2#濾柱中，生物膜一接觸SMX 就立即誘導(dǎo)出反硝化菌，Denitritisoma的相對(duì)豐度從0.01%分別增加到3.29%、14.94%、10.43%和13.89%，相對(duì)比例較高。反硝化菌可以充分降解SMX 并利用死亡微生物的殘?bào)w，因此減輕了SMX 對(duì)厭氧氨氧化生物膜的毒性，因而2#濾柱始終處于抑制程度較輕的狀態(tài)。

圖4 屬水平的微生物分類結(jié)果Fig.4 Microbial classification results at the genus level

2.5 SMX和OTC影響微生物活性的機(jī)理

通過(guò)比較1#和2#生物膜在不同抗生素中分別暴露相同時(shí)間后的活性、微生物特征、污泥性能可得知，在短期和長(zhǎng)期作用中SMX 對(duì)厭氧氨氧化生物膜的影響較小。結(jié)合EPS 的結(jié)果來(lái)看，生物膜在接觸低濃度的SMX 后，微生物快速響應(yīng)，分泌出大量的EPS，EPS 可以快速吸附抗生素，阻止其進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，因而也減輕了其毒性。在后續(xù)不同濃度下，EPS 含量逐漸增多，直到SMX 濃度達(dá)到1000 μg/L時(shí)，微生物受到抑制，分泌的EPS 不足以抵抗SMX的毒性，因而生物膜活性降低，AAOB 豐度下降。有研究報(bào)道，微生物可以通過(guò)生長(zhǎng)代謝或共代謝的方式對(duì)SMX進(jìn)行轉(zhuǎn)化或部分降解，或者把SMX作為碳源和能源，將其徹底降解或者轉(zhuǎn)化。Wen 等[38]采用A/O-MBR 工藝處理含SMX 的污水，處理系統(tǒng)中SMX 濃度為3 mg/L 時(shí)，生物降解作用去除了90.07%的SMX，系統(tǒng)氨氮去除率能夠穩(wěn)定在90%以上。另有研究表明，絕大多數(shù)SMX 降解菌都屬于Proteobacteria 菌門[39]，尤其是革蘭陰性菌對(duì)SMX 具有較強(qiáng)的降解能力[40]。而本文測(cè)序結(jié)果表明，Proteobacteria 菌門占比相對(duì)較高，多種反硝化菌均屬于該菌門，同時(shí)厭氧氨氧化系統(tǒng)中主要微生物均為革蘭陰性菌，由此推斷該系統(tǒng)對(duì)SMX 有一定的降解作用。而結(jié)合微生物種群的變化可知，厭氧氨氧化生物膜在接觸SMX 后，快速誘導(dǎo)出反硝化菌，且反硝化菌的比例快速增長(zhǎng)，并以SMX 為碳源進(jìn)行反硝化，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了SMX 的降解和進(jìn)一步脫氮?？傊┞对赟MX 中的生物膜，通過(guò)快速的EPS 響應(yīng)及相應(yīng)的屬水平轉(zhuǎn)移，能夠適應(yīng)1000 μg/L 以下的SMX。

而暴露在OTC 中的生物膜則表現(xiàn)出不同的性能。厭氧氨氧化生物膜在最初接觸OTC 后，并未受到明顯的影響，這也間接導(dǎo)致微生物沒(méi)有快速啟動(dòng)響應(yīng)機(jī)制，相對(duì)豐度反而在受到刺激后表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)，從16.4%增加到23.4%。然而，在OTC 的濃度增加到10 μg/L之后，微生物在短期暴露中受到強(qiáng)烈的抑制，活性明顯下降，雖然在長(zhǎng)期暴露中有所適應(yīng)，抑制程度減輕，但依然導(dǎo)致了厭氧氨氧化菌的相對(duì)豐度降低為10.7%，而此時(shí)雖然EPS 大量增加，但并不足以抵抗其抑制。同時(shí)此類抗生素能夠特異性地與細(xì)菌核糖體30S 亞基的A 位置結(jié)合，阻止氨基酰-tRNA 在該位置上的聯(lián)結(jié)，從而抑制肽鏈的增長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成[23,41]，因而導(dǎo)致了較深的抑制程度。研究表明，長(zhǎng)期接觸四環(huán)素會(huì)抑制氨單加氧酶的合成，使氨氧化過(guò)程受到抑制[42]，這有可能是OTC抑制厭氧氨氧化過(guò)程的主要原因。此外，反硝化菌在整個(gè)過(guò)程中沒(méi)有得到足夠的誘導(dǎo)，僅在OTC 濃度為1000 μg/L時(shí)其相對(duì)豐度有明顯的增加，這可能是由于反硝化菌不能快速降解OTC，同時(shí)該生物膜內(nèi)并沒(méi)有大量產(chǎn)生SMP 供反硝化菌所利用的原因。因此，同樣濃度的OTC 對(duì)厭氧氨氧化表現(xiàn)出顯著抑制。

3 結(jié) 論

（1）厭氧氨氧化生物膜在1～1000 μg/L 的OTC和SMX 中短期（6 h）和長(zhǎng)期（22 d）暴露結(jié)果表明，OTC 對(duì)厭氧氨氧化活性影響較大，且厭氧氨氧化菌對(duì)于0～100 μg/L 的OTC 具有適應(yīng)性，而SMX 短期和長(zhǎng)期暴露均對(duì)厭氧氨氧化無(wú)顯著影響。

（2）厭氧氨氧化生物膜對(duì)SMX 的響應(yīng)更加快速，可快速增加EPS 的分泌量。EPS 的大量分泌有助于厭氧氨氧化菌抵抗SMX的毒性抑制。

（3）AAOB 相對(duì)豐度對(duì)抗生素的響應(yīng)為：先受刺激增強(qiáng)再被抑制。SMX 的加入誘導(dǎo)反硝化菌大量增殖，從0.01%最高增加到14.94%，與厭氧氨氧化菌共同完成脫氮并降解SMX，因而SMX 對(duì)生物膜脫氮性能影響較小。