指紋圖譜技術(shù)在蛋白基食品品質(zhì)鑒定中的應(yīng)用

何曉峰，溫小波，滕 博*

（汕頭大學(xué)理學(xué)院，廣東 汕頭 515063）

前 言

隨著生活水平的提升，人們對(duì)食品質(zhì)量、食品安全的要求隨之提高.蛋白質(zhì)是人體必需的六大營養(yǎng)元素之一，從膳食中補(bǔ)充蛋白質(zhì)是人體攝入蛋白質(zhì)的主要來源[1].為確保蛋白基食品的安全和質(zhì)量，我們需要建立完善的食品質(zhì)量監(jiān)管體系.目前已有相當(dāng)多的食品質(zhì)量分析和評(píng)價(jià)的方法，但是由于食品成分的復(fù)雜多變性，難以形成一個(gè)普遍有效的質(zhì)量監(jiān)控體系.指紋圖譜技術(shù)則能夠?qū)κ称方M分進(jìn)行全面分析[2]，可以特異性的表征食品內(nèi)各營養(yǎng)成分的相互關(guān)系，在食品品質(zhì)分析、摻假摻雜檢測(cè)、產(chǎn)地鑒別等方面已得到廣泛應(yīng)用.

指紋圖譜技術(shù)針對(duì)食品組分的多樣性和復(fù)雜性特點(diǎn)，借助光譜、色譜等現(xiàn)代分析手段，獲取能夠體現(xiàn)食品共有特性的圖譜[3-5].指紋圖譜具有整體性、專屬性、穩(wěn)定性等特點(diǎn)，是一種有效的食品分析工具.蛋白質(zhì)是蛋白基食品的主要營養(yǎng)成分，具有數(shù)量大、種類多、易變化的特點(diǎn).蛋白質(zhì)指紋圖譜能很好地反映該蛋白基食品的特征，在蛋白基食品的生產(chǎn)質(zhì)量管理、品質(zhì)鑒定等方面有很大的應(yīng)用價(jià)值[6].本文對(duì)近年來指紋圖譜技術(shù)在蛋白基食品品質(zhì)分析方面的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，以期為蛋白基食品質(zhì)量管理體系的建立提供參考.

1 光譜法

光譜法是基于物質(zhì)與輻射能作用時(shí)，測(cè)量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化的能級(jí)之間的躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長和強(qiáng)度的方法.由于其簡便快速，靈敏度高的特性，在蛋白基食品分析方面應(yīng)用廣泛.常用的有傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜、拉曼光譜、圓二色光譜、X射線衍射等，另外還有核磁共振波譜、質(zhì)譜等方法.

1.1 傅里葉變換紅外光譜法（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）

傅里葉變換紅外光譜是在紅外分光光度計(jì)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的第三代紅外光譜技術(shù)，是計(jì)算機(jī)技術(shù)與紅外光譜技術(shù)相結(jié)合的應(yīng)用，其將檢測(cè)到的干涉信號(hào)，經(jīng)過計(jì)算機(jī)的傅里葉變換，從而得到分辨率更高的圖譜.在紅外光的照射下，樣品中的分子會(huì)吸收特定波長的電磁波，進(jìn)而產(chǎn)生振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)躍遷，引起偶極矩發(fā)生不同的變化，通過檢測(cè)這些變化，就能得到該樣品的特征紅外光譜.FTIR絕大多數(shù)有機(jī)物的基頻吸收帶一般都出現(xiàn)在中紅外區(qū)（4 000～400 cm-1）[7]，這一區(qū)域又分為官能團(tuán)區(qū)（3 700～1 700 cm-1）和指紋區(qū)（1 700～650 cm-1），官能團(tuán)區(qū)峰少，比較固定，容易解析；指紋區(qū)峰復(fù)雜，變化大，可用于鑒定蛋白質(zhì)的官能團(tuán)以及蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)研究.蛋白質(zhì)在指紋區(qū)主要有3個(gè)特征帶（酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶），分別是由C＝O的伸縮振動(dòng)、N-H伸縮振動(dòng)及彎曲振動(dòng)、C-N伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收帶[8].Ashwini Kher等[9]人使用FTIR研究發(fā)現(xiàn)，不同噴霧干燥的乳蛋白濃縮粉的酰胺Ⅰ和Ⅱ帶以及指紋區(qū)的紅外光譜經(jīng)過二階導(dǎo)數(shù)和歸一化處理去除物理性差異后，酰胺Ⅰ帶的α-螺旋和β-折疊與酰胺Ⅱ帶的峰形、譜帶位移、吸收強(qiáng)度等變化顯著，該指紋圖譜可以很好地區(qū)分經(jīng)過不同加工處理的乳蛋白粉.

FTIR圖譜不僅可以研究蛋白質(zhì)官能團(tuán)的變化，經(jīng)過去卷積、二階導(dǎo)數(shù)、歸一化、高斯擬合等處理之后，還可以得到其二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化信息.Manpreet等[10]將牛奶蛋白的紅外光譜指紋圖譜進(jìn)行以上處理后，選取1 700～1 500 cm-1（酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶）區(qū)域進(jìn)行高斯曲線擬合，發(fā)現(xiàn)不同處理的牛奶蛋白其酰胺Ⅰ帶的α-螺旋（1 654～1 658 cm-1）、β-折疊（1 623～1 643 cm-1和 1 689～1 698 cm-1）、β-轉(zhuǎn)角（1 666～1 687 cm-1）、無規(guī)則卷曲（1 646～1 650 cm-1）條帶變化明顯，根據(jù)高斯曲線積分面積還可以估算出各二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量百分比，這種指紋識(shí)別方法可以明顯地識(shí)別出各種不同處理后的牛奶蛋白.目前F TIR大多采用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR），該法操作簡便，樣品無需前處理，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的無損檢測(cè)，已廣泛應(yīng)用于各種固體以及液體樣品的分析.Aloglu等[11]利用ATR-FTIR結(jié)合模式識(shí)別方法，根據(jù)蛋白質(zhì)紅外光譜特征成功鑒定出牛明膠、豬明膠和魚明膠，表明ATR-FTIR可用于鑒別動(dòng)物明膠來源.

1.2 熒光光譜法（Fluorescent spectrometry，F(xiàn)S）

熒光是電子吸收光子能量后，產(chǎn)生振動(dòng)躍遷，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，以輻射躍遷方式失去的能量.蛋白質(zhì)發(fā)熒光的原因是其中含有芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）或者蛋白質(zhì)活性中心含有金屬原子等內(nèi)源性熒光基團(tuán)[12].熒光基團(tuán)的種類、含量以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)等都會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度、熒光波長、熒光壽命等性質(zhì)產(chǎn)生影響，因此蛋白質(zhì)熒光光譜具有一定的指紋性，可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定、結(jié)構(gòu)分析、相互作用分析、動(dòng)力學(xué)分析等.例如Kokawa等[13]根據(jù)蛋白質(zhì)受熱結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變這一特性，建立了豆奶在不同溫度加熱下的熒光指紋圖譜，結(jié)合偏最小二乘模型分析，成功預(yù)測(cè)了不同狀態(tài)豆奶制品的加熱溫度，這對(duì)于豆奶的生產(chǎn)可以起到品質(zhì)控制的作用.然而并不是所有的蛋白質(zhì)都可以產(chǎn)生熒光，對(duì)于沒有熒光特性的蛋白質(zhì)，可以通過熒光染料、熒光探針、熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)芯片等方法，將熒光物質(zhì)與被檢測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)熒光信號(hào)增強(qiáng)或減弱或猝滅，從而達(dá)到目標(biāo)蛋白檢測(cè)的目的.YuKi等[14]采用熒光標(biāo)記結(jié)構(gòu)肽制備的蛋白質(zhì)芯片，建立了一種快速檢測(cè)病人唾液中的蛋白質(zhì)從而確定病人是否患有牙周病的方法.實(shí)驗(yàn)表明，通過檢測(cè)標(biāo)記肽的熒光強(qiáng)度變化得到的熒光指紋圖譜，可以鑒定出健康者與患牙周病患者.

熒光光譜法中，根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)的不同，又分為同步熒光光譜[15]、前表面熒光光譜[16]、三維熒光光譜等，其中三維熒光光譜以熒光強(qiáng)度、激發(fā)波長、發(fā)射波長作為維度，其立體圖譜能夠反映物質(zhì)的熒光強(qiáng)度隨著激發(fā)波長和發(fā)射波長而變化，所得的信息更為豐富，在構(gòu)建指紋圖譜方面具有廣泛應(yīng)用.牛乳中含有豐富的發(fā)色基團(tuán)，具有不同的激發(fā)和發(fā)射波長，而且還有多種類型的蛋白質(zhì)，可以結(jié)合不同的熒光染料；根據(jù)這兩個(gè)特點(diǎn)，杜麗娟[17]采集了生鮮乳和摻入奶粉的還原乳的三維內(nèi)源熒光光譜和二維外源熒光圖譜，結(jié)合分類模型分析方法發(fā)現(xiàn)這兩種圖譜均可以用于判定還原乳的摻假程度，其準(zhǔn)確率高達(dá)100%.

1.3 拉曼光譜法（Raman spectroscopy，RS）

入射光子和分子發(fā)生碰撞時(shí)，發(fā)生了能量轉(zhuǎn)移，引起分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)，使入射光波長頻率發(fā)生改變的非彈性散射稱為拉曼散射，偏移的波數(shù)稱為拉曼頻移，其只與分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)有關(guān).拉曼光譜圖與紅外光譜圖相似，是紅外光譜的補(bǔ)充，它根據(jù)蛋白質(zhì)分子的振動(dòng)程度來構(gòu)建蛋白質(zhì)指紋圖譜，目前是檢測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、分子結(jié)構(gòu)及構(gòu)象的主流方法之一[18].與紅外相比，它具有不受水分子干擾的優(yōu)點(diǎn)，更適用于不同狀態(tài)樣品的檢測(cè).楊雪倩等[19]利用共聚焦拉曼光譜構(gòu)建了不同霉變程度玉米的黃曲霉毒素（AFB1）和玉米赤酶烯酮（ZEN）的拉曼圖譜，數(shù)據(jù)經(jīng)過GaussLor擬合預(yù)處理，找到420～550 cm-1、790～980 cm-1和1 050～1 500 cm-1三個(gè)特征波段，歸屬為玉米毒素所在區(qū)域，以特征波長建立的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型可以更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)AFB1和ZEN含量的預(yù)測(cè)，這為谷物品質(zhì)的快速檢測(cè)提供了參考.Yin等[20]對(duì)大豆球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拉曼光譜分析發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由21.50%的α-螺旋、41.62%的β-折疊、24.70%的β-轉(zhuǎn)角和12.18%的無規(guī)則卷曲組成.

近年來，一些能提高拉曼光譜分辨率的衍生技術(shù)得到了飛速發(fā)展，例如紫外線共振拉曼光譜（UVRR）、深紫外線共振拉曼光譜（DUVRR）、表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）、紅外-拉曼光譜聯(lián)用（IR-RS）等.其中SERS具有超高靈敏度特性，該技術(shù)能夠極大限度地提供蛋白質(zhì)樣品固有的指紋信息.Tian等[21]通過分析溶菌酶和細(xì)胞色素c兩種蛋白質(zhì)主鏈的酰胺Ⅲ帶的SERS信號(hào)，發(fā)現(xiàn)隨著蛋白質(zhì)濃度的增大，溶菌酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中的無規(guī)則卷曲會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋和β-折疊；而細(xì)胞色素c的二級(jí)結(jié)構(gòu)仍保持恒定的比例.以上研究表明我們可以通過拉曼光譜的方法建立蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的指紋圖譜，用以分析蛋白基食品在不同情況下的變化，從而進(jìn)行品質(zhì)控制.

1.4 圓二色光譜法（Circular dichroism spectroscopy，CD）

當(dāng)光經(jīng)過光學(xué)活性物質(zhì)時(shí)，介質(zhì)對(duì)左旋、右旋圓偏振光的吸收系數(shù)不同，二者的差值即為該物質(zhì)的圓二色性.具有圓二色性的物質(zhì)能夠使平面偏振光偏轉(zhuǎn)為橢圓偏振光，橢圓度與吸收系數(shù)差值成正比，圓二色光譜則是記錄平面偏振光的波長與吸收系數(shù)差值的圖譜.蛋白質(zhì)是具有圓二色性的物質(zhì)，其中的光學(xué)活性基團(tuán)主要有肽鍵、芳香族氨基酸殘基、二硫橋鍵，蛋白質(zhì)光學(xué)活性不僅受基團(tuán)影響，還受蛋白質(zhì)折疊的影響[22]，因此可以得到具有特征性的圓二色光譜.蛋白質(zhì)的圓二色光譜主要在較稀的溶液狀態(tài)下測(cè)定，對(duì)于樣品的純度和制樣要求較高，可以得到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息.李萌等[23]使用CD法得到羊乳和牛乳β-酪蛋白的圓二色圖譜，分別在192 nm、185～200 nm、200 nm、206 nm的正峰出現(xiàn)α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角的特征峰；分析結(jié)果表明，羊乳β-酪蛋白的無規(guī)卷曲含量比牛乳β-酪蛋白更高，分子結(jié)構(gòu)趨向無序.Vanga等[24]采用CD法探究了脈沖超聲加工對(duì)杏仁乳蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，隨著超聲時(shí)間延長，杏仁乳蛋白中的α-螺旋有向β-折疊轉(zhuǎn)變的趨勢(shì).楊嬌等[25]建立了兩種不同干燥方式處理下的馬鈴薯蛋白質(zhì)CD圖譜，比較兩者圖譜發(fā)現(xiàn)，高壓電場(chǎng)干燥（HVEF）會(huì)使蛋白質(zhì)α-螺旋減少，其他二級(jí)結(jié)構(gòu)增加，但總體變化比例相較于熱風(fēng)干燥對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的變化更小，這說明HVEF更適合對(duì)馬鈴薯進(jìn)行加工.雖然圓二色光譜應(yīng)用廣泛，但也存在一些局限，例如樣品中存在光吸收的雜質(zhì)和緩沖液時(shí)會(huì)產(chǎn)生光散射現(xiàn)象，以及氙弧燈在200 nm以下波長區(qū)時(shí)發(fā)出的光源強(qiáng)度會(huì)突然下降，這些情況的出現(xiàn)對(duì)CD光譜的質(zhì)量有較大的干擾，為了克服這些不足，逐漸發(fā)展起了一種利用同步加速器光束的輻射作為光源來采集樣品CD信息的方法，這種方法稱為同步輻射圓二色光譜（SRCD）[26].SRCD不僅可以研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化，還可以監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化.Jochen等[27]使用SRCD研究了不同熱處理下膠原納米纖維的結(jié)構(gòu)變化，隨著加熱溫度的提高，原膠原納米纖維的Ⅱ型聚脯氨酸（PP-Ⅱ）含量從60%～70%下降到30%～40%，并且膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開.這些研究證明了CD法是構(gòu)建蛋白質(zhì)指紋圖譜的有利工具，在蛋白基食品品質(zhì)控制方面具有重要作用.

1.5 核磁共振波譜法（Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）

核磁共振波譜法是一種波譜技術(shù)，它的工作原理是添加一個(gè)入射頻率與原子核自旋進(jìn)動(dòng)頻率相同的射頻場(chǎng)，原子核吸收射頻場(chǎng)的能量，由低能態(tài)躍遷到高能態(tài)，從而產(chǎn)生核磁共振的現(xiàn)象.同一種原子核在不同的化學(xué)環(huán)境中具有不同的核磁共振頻率，因此通過核磁共振，可以知道原子核的化學(xué)位移、共振信號(hào)強(qiáng)度等特征信息[28]，進(jìn)而得到被分析物質(zhì)的化學(xué)組成、基團(tuán)結(jié)構(gòu)，所以NMR是構(gòu)建指紋圖譜的強(qiáng)有力工具.近年來，核磁共振代謝指紋圖譜在蛋白基食品鑒定的靶向和非靶向分析中得到廣泛應(yīng)用.Tenori等[29]人開發(fā)出了一種快速、可重復(fù)的牛奶核磁共振代謝組學(xué)指紋圖譜分析方法，使用偏最小二乘模型（PLS-CA）對(duì)不同農(nóng)場(chǎng)出產(chǎn)的牛奶進(jìn)行1H-NMR圖譜分析，發(fā)現(xiàn)不同農(nóng)場(chǎng)的奶牛產(chǎn)出的牛奶其代謝物含量差異明顯，從而明確區(qū)分有機(jī)奶和非有機(jī)奶，以及識(shí)別不同品牌的牛奶.Longobardi等[30]使用核磁共振氫譜分析了不同地理來源的扁豆的代謝物，認(rèn)為代謝譜中的異亮氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、天冬氨酸、檸檬酸鹽等信號(hào)區(qū)域是鑒別扁豆地理來源的重要依據(jù).

信噪比是信號(hào)強(qiáng)度與噪聲的比值，用于判斷NMR圖譜的質(zhì)量.傳統(tǒng)NMR圖譜信噪比不高，在弱信號(hào)物質(zhì)分析方面有很大缺陷，隨著技術(shù)進(jìn)步，已經(jīng)發(fā)展出多種高分辨核磁共振波譜法，例如脈沖傅里葉變換NMR、低場(chǎng)核磁共振及成像技術(shù)（LF-NMR-MRI）、高分辨率魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振（HRMAS-NMR）、二維及多維核磁共振圖譜等.Sujatha等[31]對(duì)來自韓國奶牛場(chǎng)的52份奶酪樣品采用1H HRMAS-NMR分析，以找到奶酪樣品的代謝物分布和濃度與感官評(píng)價(jià)的相關(guān)性.多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，根據(jù)感官評(píng)價(jià)分組的奶酪，不同組之間氨基酸和有機(jī)酸含量差異顯著，是由不同加工過程中蛋白質(zhì)水解和代謝造成，奶酪的1H HRMAS-NMR代謝指紋圖譜與感官品質(zhì)評(píng)價(jià)一致.

1.6 X射線衍射法（X-ray diffraction，XRD）

晶體中的原子排列具有周期性，當(dāng)用X射線照射晶體時(shí)，由于X射線的波長與原子面間的距離相近，不同的原子會(huì)對(duì)X射線產(chǎn)生不同方向的散射，散射的X射線相互干涉，從而形成衍射圖譜，這種方法稱為X射線衍射法.XRD可以得到蛋白晶體的原子結(jié)構(gòu)信息，是目前研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)最常用的方法之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（PDB）儲(chǔ)存的90%左右蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)都是由XRD法測(cè)得[32].不同蛋白質(zhì)其空間結(jié)構(gòu)不一樣，具有特征性，因此XRD法非常適合用來構(gòu)建蛋白質(zhì)指紋圖譜，能得到更全面的蛋白質(zhì)信息.蛋白基食品大多為非結(jié)晶態(tài)，其中含有較多較雜且大分子量的蛋白質(zhì)，較難得到純的蛋白質(zhì)晶體，但是利用XRD依然可以計(jì)算得到其結(jié)晶度、肽鏈距離、非結(jié)晶成分等信息.Chen等[33]通過XRD研究了不同高壓對(duì)肌原纖維蛋白粉的加工作用，在2θ值為20°時(shí)，發(fā)現(xiàn)明顯的非晶態(tài)結(jié)構(gòu)峰，且隨著壓力的增加，達(dá)到15 000 psi時(shí)，肌原纖維結(jié)構(gòu)完全被破壞，其非晶態(tài)結(jié)構(gòu)峰值強(qiáng)度達(dá)到最低，表明加工后蛋白粉形成更多排列有序的晶體結(jié)構(gòu)，但在壓力達(dá)到20 000 psi時(shí)，過度加工會(huì)破壞這些晶體結(jié)構(gòu)，使得非晶態(tài)結(jié)構(gòu)峰值強(qiáng)度升高.Zhang等從小牛皮中提取膠原蛋白，經(jīng)過超聲處理后，使用XRD計(jì)算膠原蛋白分子鏈間的距離，根據(jù)布拉格方程：得到四種不同處理的膠原蛋白分子鏈間距離分別為1.197，1.190，1.187，1.180 nm；多肽鏈間的距離分別為0.285，0.281，0.287和0.292 nm.這些數(shù)據(jù)表明，超聲波以及膠原蛋白濃度對(duì)膠原結(jié)構(gòu)不會(huì)產(chǎn)生影響.Zhu等[34]對(duì)比了從鰩魚和鱘魚軟骨提取的酸溶性膠原蛋白（ASC）和酶溶性膠原蛋白（PSC）的XRD圖譜，ASC和PSC都顯示含有兩個(gè)衍射峰，第一個(gè)尖峰出現(xiàn)在5°～10°，代表膠原蛋白分子鏈間的距離；第二個(gè)寬峰出現(xiàn)在20°，為膠原內(nèi)非晶態(tài)區(qū)域的彌散散射形成.結(jié)合CD和XRD的數(shù)據(jù)分析，表明這兩種提取方法得到的膠原蛋白具有完整的三重螺旋結(jié)構(gòu).

XRD在蛋白質(zhì)方面主要用于結(jié)構(gòu)解析以及動(dòng)態(tài)變化過程，目前發(fā)展出許多新型的X射線衍射技術(shù)，例如同步輻射X射線衍射、小角X射線衍射、廣角X射線衍射、X射線自由電子激光衍射等，不僅能夠更精確的表征蛋白質(zhì)晶體，甚至有可能實(shí)現(xiàn)非晶體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析，因此，XRD是構(gòu)建蛋白質(zhì)指紋圖譜的潛在有力方法.

1.7 質(zhì)譜法（Mass spectrography，MS）

質(zhì)譜的原理是物質(zhì)分子在離子源的轟擊下失去電子，并裂解為不同的陽離子，陽離子在電場(chǎng)和磁場(chǎng)雙重作用下，按照質(zhì)荷比（m/z）大小依次排列成譜.質(zhì)譜法如今已成為蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究的重要手段之一[35]，可以精確測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、元素組成、碳骨架及官能團(tuán)結(jié)構(gòu)信息，這些信息恰恰是蛋白質(zhì)的“指紋”，因此也可以采用MS法構(gòu)建蛋白質(zhì)指紋圖譜，用于食品的品質(zhì)控制[36].質(zhì)譜只能分析純品物質(zhì)，復(fù)雜以及大分子量的樣品例如食品中的蛋白質(zhì)則需要與高效液相色譜（HPLC）聯(lián)用才能進(jìn)行分析，這使得HPLC-MS聯(lián)用成為蛋白質(zhì)組學(xué)的主要方法.Gu等[37]通過超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道高分辨率質(zhì)譜（UPLC-Q-Exactive-HRMS）分離大西洋鮭魚和虹鱒魚的酶解多肽，再通過三重四極桿質(zhì)譜（LC-QQQ-MS）進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）分析，篩選出5種特異性肽生物標(biāo)記物.最后以是否含有特異性肽GDPGPGGPQGEQGVVGPAGISGDK，對(duì)不同地區(qū)和不同批次的37個(gè)真實(shí)樣品以及市售加工產(chǎn)品進(jìn)行測(cè)試，檢測(cè)出2個(gè)大西洋鮭魚摻假樣品.Ma等[38]也采用了同樣的蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒別食用燕窩及其摻假品.其篩選出的28個(gè)特異性肽標(biāo)記物可用于區(qū)分燕窩與摻假品，這些特異性肽主要來源于酸性幾丁質(zhì)酶、賴氨酰氧化酶3、I型膠原α1鏈和α2鏈、溶菌酶、卵鐵傳遞蛋白、卵清蛋白、ATP合成酶等.這為食品的摻假檢測(cè)提供了有效、可靠的策略.此外，還有人通過LC-MS/MS來構(gòu)建膠原蛋白肽質(zhì)量指紋圖譜，成功鑒定出11種魚類[39].

質(zhì)譜根據(jù)離子源的不同可以分為電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）、熱噴霧離子化質(zhì)譜（HEIMS）、二次離子質(zhì)譜（SIMS）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS），再搭配不同的質(zhì)量分析器（四極桿、飛行時(shí)間、離子阱），可以實(shí)現(xiàn)不同的檢測(cè)需求.目前LC-MS和MS-MS串聯(lián)使用的方法在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析以及多肽氨基酸特異性序列分析中應(yīng)用較多，這種方法更靈敏、分辨率更高、更精確，甚至僅用一段多肽就能鑒別蛋白質(zhì).這說明可以通過特征肽段來構(gòu)建蛋白質(zhì)指紋圖譜[40]，用于食品蛋白質(zhì)分析和鑒別.

2 色譜法

色譜法利用物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相之間選擇性分配的原理，在流動(dòng)相的推動(dòng)下，混合物中各組分以不同速度沿固定相移動(dòng)，從而達(dá)到分離的目的.與光譜法相比，色譜法在分離和定量分析特定物質(zhì)方面更有優(yōu)勢(shì)，在食品檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛.而蛋白質(zhì)組學(xué)的興起，推動(dòng)了色譜與質(zhì)譜聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展，使得高通量蛋白質(zhì)檢測(cè)得以實(shí)現(xiàn)，可以對(duì)各種基質(zhì)中成千上萬種蛋白質(zhì)進(jìn)行全面的定性和定量分析.目前已有許多學(xué)者將這種聯(lián)合技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)指紋圖譜分析中，其中應(yīng)用最多的是高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，其次還有高效薄層色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、高速逆流色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、高效毛細(xì)管電泳等.

2.1 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）

高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatograph，HPLC）具有的高壓、高速、高效、高靈敏度以及適用性強(qiáng)等特點(diǎn)，使得高效液相色譜成為如今應(yīng)用最廣泛的分離檢測(cè)技術(shù).在食品蛋白質(zhì)的分離分析方面，體積排阻色譜法（SEC）和反相高效液相色譜法（RP-HPLC）應(yīng)用最多，已有一些學(xué)者將其用于食品蛋白質(zhì)指紋圖譜的構(gòu)建，例如牛奶、水牛乳、蛤蟆油等.然而HPLC只是一種分離技術(shù)，能提供的蛋白質(zhì)信息比較有限，HPLC-MS聯(lián)用則結(jié)合了兩者的優(yōu)點(diǎn)，不僅可以對(duì)蛋白質(zhì)做到快速的定性定量分析，還可以獲得蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息等，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)指紋圖譜的代表性[41].此外，HPLC-MS在多肽分析方面更是有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，有學(xué)者提出用肽質(zhì)量指紋圖譜[36]鑒別蛋白質(zhì)或食品.這種基于特征多肽的蛋白質(zhì)鑒定思路是：先提取樣品中的蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，得到多肽，經(jīng)過高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜檢測(cè)，并與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對(duì)，篩選得到特征多肽，再通過HPLC-QQQ-MS和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法得到特征多肽的總離子流圖譜進(jìn)行驗(yàn)證.Wong等[42]以HPLC-MS聯(lián)用法分析了不同品種和來源的燕窩及其摻假品的多肽指紋圖譜，其結(jié)果表明燕窩正品與摻假品多肽指紋圖譜差異顯著，并鑒定出燕窩中的兩種主要生物標(biāo)記蛋白：Muc-5AC蛋白和AMCase蛋白.張淑霞等[43]結(jié)合HPLC-Q-Exactive-HRMS和HPLC-QQQ-MS篩選得到核桃、杏仁、大豆、花生的特征多肽，經(jīng)過驗(yàn)證，這種基于特征多肽的方法可以鑒別出核桃露、杏仁露中是否摻入了大豆或者花生蛋白，大豆和花生的最低檢出限分別為：1.3和6.8 mg/kg，具有較高的靈敏度.這為蛋白基食品的多肽指紋圖譜的構(gòu)建提供了參考.

蛋白質(zhì)指紋圖譜的準(zhǔn)確性，取決于蛋白質(zhì)在色譜中分離的效率.近年來，一些新型的HPLC技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來，例如超高效液相色譜（UPLC），它具有比HPLC更好的分離效率和分辨率，在檢測(cè)領(lǐng)域上的應(yīng)用逐年增多.Lu等[44]采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF-MS）構(gòu)建了牛奶的多肽指紋圖譜，可以區(qū)分牛奶是否摻入了植物蛋白，準(zhǔn)確率達(dá)到95%.液體牛奶和奶粉的蛋白質(zhì)種類相似，當(dāng)往牛奶中摻入奶粉，則很難被檢測(cè)出來，Du等[45]則建立了一種用UPLC-QTOF-MS檢測(cè)液體牛奶是否摻入奶粉的方法，其通過比較兩者的完整蛋白質(zhì)指紋圖譜和肽指紋圖譜進(jìn)行區(qū)分.此外，還有二維及多維HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)，例如凝膠過濾色譜-HPLC-MS/MS技術(shù).多維HPLC-MS具有更高的分辨率，峰容量的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的精確檢測(cè)，這對(duì)于食品蛋白質(zhì)指紋圖譜的構(gòu)建來說是非常有用的工具.

2.2 高效薄層色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPTLC-MS）

高效薄層色譜（High performance thin layer chromatography，HPTLC）是采用特制的高效薄層板以及多級(jí)展開或分級(jí)展開等展開技術(shù)來提高薄層色譜的靈敏度和準(zhǔn)確性的方法.如今HPTLC已具有數(shù)字掃描和自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，并且開發(fā)出可以直接從HPTLC板上洗脫樣品到質(zhì)譜儀上的裝置——CAMAG[46]，使得HPTLC-MS聯(lián)用成為可能.Sherma[46]報(bào)道了一種使用HPTLC-ESI-MS/MS方法建立葡萄酒中酪蛋白和卵清蛋白酶解多肽的指紋圖譜，用以快速識(shí)別葡萄酒中是否含有過敏原.Esparza等[47]直接在TLC板上對(duì)α-氨基酸進(jìn)行固定電荷衍生，再進(jìn)行MALDI-MS分析，得到各α-氨基酸的Rf值色譜圖和質(zhì)譜圖.結(jié)果表明，不同α-氨基酸均得到良好的分離，且這種衍生化后再進(jìn)行MS分析方法的靈敏度很高，可以用于膳食中的氨基酸甚至寡肽的檢測(cè).以上研究表明HPTLC-MS在蛋白質(zhì)類的研究中具有較大的潛力，可以運(yùn)用到食品中的蛋白質(zhì)指紋圖譜的構(gòu)建.

2.3 高速逆流色譜-質(zhì)譜法（HSCCC-MS）

高速逆流色譜（High-speed countercurrent chromatography，HSCCC）利用流體動(dòng)力學(xué)原理，通過控制螺旋管的方向與高速同步行星式運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生一個(gè)二維力場(chǎng)，使相對(duì)移動(dòng)的互不相溶的兩相（一相作為固定相，另一相作為流動(dòng)相）在高速旋轉(zhuǎn)下實(shí)現(xiàn)高效的萃取頻率，最后使樣品組分按照不同的分配系數(shù)依次分離.HSCCC在天然產(chǎn)物的分離純化方面應(yīng)用較多，由于其無不可逆吸附、無需色譜柱和能有效保護(hù)活性物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，近年來在蛋白質(zhì)和多肽分離純化研究方面的應(yīng)用逐漸增多[48]，HSCCC-MS的聯(lián)用能夠更全面的分析蛋白質(zhì)和多肽.Dong等[49]采用MCI凝膠柱層析-HSCCC-電噴霧高分辨串聯(lián)質(zhì)譜法，從球蛋白多肽中分離純化得到高濃度的val-val-tyr-pro活性多肽.Li等[50]人利用HSCCC的反膠束溶劑體系來分離純化苦瓜中的蛋白質(zhì).MALDI-TOF/TOF-MS/MS成功鑒定出3種蛋白質(zhì)（抗性蛋白P-B、五肽重復(fù)序列蛋白和具有抗癌作用的新型蛋白）.HSCCC的快速純化能力能夠滿足MS對(duì)蛋白質(zhì)樣品純度的要求，兩者聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)快速對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，這對(duì)食品中蛋白質(zhì)的分析以及蛋白質(zhì)指紋圖譜的建立方面具有很大的應(yīng)用潛力.

2.4 高效毛細(xì)管電泳（HPCE）

高效毛細(xì)管電泳（High performance capillary electrophoresis，HPCE）是一種以高壓電場(chǎng)為推動(dòng)力，毛細(xì)管為分離通道，根據(jù)樣品各組分之間的淌度和分配行為的差異進(jìn)行分離分析的方法，其結(jié)合了色譜和電泳兩種分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn).廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)類藥物、生物液體蛋白質(zhì)、食品蛋白質(zhì)、農(nóng)產(chǎn)品蛋白質(zhì)的分析和質(zhì)量控制等多個(gè)方面[51].張政等[52]人建立了以25個(gè)共有峰為代表的全蝎酶解液蛋白類成分（＞10 kDa）的HPCE指紋圖譜，可用于鑒別全蝎蛋白類成分.李克宏等[53]建立了不同產(chǎn)地核桃、杏仁、大豆、花生的HPCE蛋白質(zhì)指紋圖譜，可作為摻假檢測(cè).Bonke等[54]通過HPCE對(duì)新型植物蛋白飲料中的氨基酸和蛋白質(zhì)組成進(jìn)行了分析，可鑒定單一和混合型植物飲料.HPCE分析不需要大量有機(jī)試劑，且操作簡單快速，還可以同時(shí)分析多個(gè)樣品，節(jié)省時(shí)間成本，在高通量蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域上有著良好的應(yīng)用前景.

綜上所述，光譜指紋圖譜技術(shù)和色譜指紋圖譜技術(shù)均適用于食品蛋白質(zhì)的分析，兩者各有優(yōu)點(diǎn)和不足（如表1）.而從近年來的發(fā)展趨勢(shì)看，多種技術(shù)的聯(lián)用將是構(gòu)建食品蛋白質(zhì)指紋圖譜的更好方法，能夠得到更全面的蛋白質(zhì)信息，更能反映食品品質(zhì)的變化，有助于食品生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制.

表1 光譜法與色譜法指紋圖譜技術(shù)的比較

3 化學(xué)計(jì)量學(xué)在指紋圖譜方面的應(yīng)用

化學(xué)計(jì)量學(xué)是一門通過統(tǒng)計(jì)學(xué)或數(shù)學(xué)方法將對(duì)化學(xué)體系的測(cè)量值與體系的狀態(tài)之間建立聯(lián)系的學(xué)科.它通過從相關(guān)和不相關(guān)的化學(xué)數(shù)據(jù)集合中提取有意義的信息來實(shí)現(xiàn)客觀的數(shù)據(jù)評(píng)估，這為光譜和色譜的數(shù)據(jù)分析提供了強(qiáng)有力的工具[55].在化學(xué)計(jì)量學(xué)中，有二個(gè)重要的組成部分，分別是相似度分析和多元統(tǒng)計(jì)分析.

3.1 相似度分析方法

相似度算法是一類用于評(píng)價(jià)多個(gè)樣本的向量或矩陣之間相似程度的算法總稱.包括夾角余弦法（inter-angle-cosine；vector cosine）[56]、相關(guān)系數(shù)法（correlation coefficient）[57]、重疊率系數(shù)法（overlap ratio coefficient）、最大-最小系數(shù)法（min-max coefficient）、歐氏距離法（euclidean distance analysis）[58]、馬氏距離法（mahalanobis distance analysis）[59]等.付江波等[56]對(duì)10批不同產(chǎn)地的藏藥八味秦皮丸的XRD指紋圖譜進(jìn)行了相似度分析，分別采用了夾角余弦法和相關(guān)系數(shù)法計(jì)算該批樣品的相似度，結(jié)果表明采用夾角余弦法進(jìn)行評(píng)價(jià)更為準(zhǔn)確，可用于八味秦皮丸的鑒定和質(zhì)量分析.

3.2 多元統(tǒng)計(jì)分析方法

多元統(tǒng)計(jì)分析方法在指紋圖譜的分析中應(yīng)用最為廣泛，它能夠?qū)悠分讣y圖譜進(jìn)行綜合分析、特征剖析和數(shù)據(jù)挖掘.根據(jù)分析原理，可分為有監(jiān)督分析方法和無監(jiān)督分析方法.

3.2.1 無監(jiān)督分析方法

無監(jiān)督分析方法，其目的是得到樣品之間的聚類或分組關(guān)系，在不知道樣品類別的情況下，常使用該法將復(fù)雜的圖譜數(shù)據(jù)以分類樹或圖的形式轉(zhuǎn)換出來進(jìn)行分析.在無監(jiān)督方法中，主成分分析（PCA）是應(yīng)用最為廣泛的分析方法，其他還有聚類分析（CA）、層次聚類（HCA）[60]、K-均值聚類（K-means）[61]、自組織映射人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（SOM-ANN）[62]等.榮菡等[62]采用偏最小二乘法（PLS）和SOM-ANN法聯(lián)用，對(duì)牛乳和摻假乳的近紅外光譜指紋圖譜進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，SOM-ANN模型對(duì)未知樣品的識(shí)別準(zhǔn)確率達(dá)到了95%，并將樣品分為了4類.表明SOM-ANN模型可用于食品的摻假鑒別.

3.2.2 有監(jiān)督分析方法

有監(jiān)督分析方法是指通過利用已知類別的樣本作為訓(xùn)練集，進(jìn)而建立分類模型，再使用模型對(duì)未知樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)、歸類的方法.這其中較為常用的有：線性判別分析（LDA）[63]、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）[45]、K最近鄰法（K-NN）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）[31]、簇類獨(dú)立軟模式分類法（SIMCA）[64]、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法（ANN）[65]、小波神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法（WNN）、典型相關(guān)分析（CCA）[66]、支持向量機(jī)（SVM）[67]、貝葉斯判別法（Bayes-DA）、反向傳播人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（BP-ANN）[68]等.

指紋圖譜可以說是反映分析樣品復(fù)雜化學(xué)成分的特征曲線，相比于其他檢測(cè)方法，其具有更大的信息量.化學(xué)計(jì)量學(xué)作為一種多變量數(shù)據(jù)分析工具，在處理整合大量信息方面有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì).因此將食品蛋白質(zhì)指紋圖譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，能夠挖掘到更多有用的信息，在蛋白質(zhì)食品摻假、溯源、品質(zhì)鑒定、生產(chǎn)監(jiān)測(cè)等方面將發(fā)揮巨大的作用.

4 結(jié)語及展望

蛋白質(zhì)作為食品不可缺少的營養(yǎng)成分，在食品的生產(chǎn)過程中能夠保持相對(duì)穩(wěn)定，且具有物種特異性，非常適合作為生物標(biāo)志物.目前蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)已廣泛用于物種鑒定、疾病診斷、藥物篩選、中藥指紋圖譜、食品質(zhì)量控制等方面，已有20多年的發(fā)展歷史，尤其是近年來，隨著各種新型儀器和分析方法的涌現(xiàn)，各種蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)不斷被開發(fā)用于食品安全和質(zhì)量控制，可以預(yù)見，未來的食品安全和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系中必有蛋白質(zhì)指紋圖譜的一席之地，這將有助于建立一個(gè)更加規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化的食品認(rèn)證和監(jiān)管體系.

為了更好的促進(jìn)食品蛋白質(zhì)指紋圖譜的發(fā)展，在此提出幾點(diǎn)建議：1.決定蛋白質(zhì)指紋圖譜好壞的最關(guān)鍵一步是蛋白質(zhì)提取技術(shù)，如何能夠快速并且高效的提取到蛋白質(zhì)，涉及到縮短蛋白質(zhì)指紋圖譜的時(shí)間成本和提高檢測(cè)效率.因此需要進(jìn)一步開發(fā)簡便而有效的蛋白質(zhì)提取技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)無損快速檢測(cè)；2.食品蛋白質(zhì)在整個(gè)生產(chǎn)過程中會(huì)有一定程度的變化，這是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，單從產(chǎn)品角度制作的蛋白質(zhì)指紋圖譜已顯不足，應(yīng)開發(fā)蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)指紋圖譜技術(shù)，用于追蹤食品的整個(gè)生產(chǎn)、銷售環(huán)節(jié)，這將會(huì)使食品的生產(chǎn)過程更加規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化.3.建立蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫共享平臺(tái)，有助于提升蛋白質(zhì)鑒定的效率.蛋白質(zhì)指紋圖譜不僅可以用于食品安全和質(zhì)量控制，也可以用于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和活性物質(zhì)，進(jìn)一步提高食品的附加值.