嗎替麥考酚酯治療小鼠間質(zhì)性肺炎的作用及風(fēng)險(xiǎn)研究

何茳萍 黃 佼

肺部病變?nèi)绶伍g質(zhì)病變、肺動(dòng)脈高壓和繼發(fā)感染等是風(fēng)濕免疫疾病最常見的系統(tǒng)表現(xiàn)之一[1]。免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)、嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil, MMF)是治療自身免疫相關(guān)肺間質(zhì)血管病變的常用藥物，有臨床研究證實(shí)免疫抑制劑可有效改善肺功能和影像學(xué)表現(xiàn)，但是其在分子層面對(duì)肺部炎癥的作用目前未見研究報(bào)道[2，3]。有個(gè)例報(bào)道雷帕霉素及MMF可能導(dǎo)致肺泡蛋白沉積癥(pulmonary alveolar proteinosis, PAP)[4，5]。筆者前期在臨床工作中也曾診治過(guò)一例繼發(fā)于MMF的PAP患者，因此MMF誘發(fā)PAP的風(fēng)險(xiǎn)值得臨床關(guān)注。本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度MMF灌藥對(duì)小鼠肺部病理結(jié)構(gòu)、炎性因子表達(dá)、肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量以及粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)水平的作用。試圖探索MMF對(duì)于改善間質(zhì)性肺病的作用以及明確是否具有引起肺泡蛋白沉積癥的潛在風(fēng)險(xiǎn)，為臨床中的精準(zhǔn)用藥提供一定的依據(jù)。

材料與方法

1.主要試劑與儀器:小鼠IL-1β抗體、TNF-α抗體購(gòu)自上海安迪生物科技有限公司，小鼠CD68抗體、β-actin抗體、TGF-β抗體購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司，GM-CSF自身抗體及GM-CSF酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司?；瘜W(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自美國(guó)通用生物系統(tǒng)公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司，光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海尼康儀器有限公司。

2.小鼠飼養(yǎng)及給藥:購(gòu)買6～8周齡的SPF級(jí)雄性C57bL/6小鼠(n=18)，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為3組(n=6),即PBS組、MMF1組和MMF2組。所有小鼠均予以5μg/g濃度的博來(lái)霉素滴鼻吸入。隨后PBS組予以等量PBS灌胃，MMF1組予以濃度為20mg/kg的MMF灌胃，MMF2組予以濃度為35mg/kg的MMF灌胃。3組小鼠均予以一天兩次灌藥，連續(xù)12周后，眼眶采血收集血清，后將小鼠安樂(lè)死，取肺組織。

3.HE染色及免疫組化：將肺組織用4%多聚甲醛固定至少24h，后續(xù)經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片、烤片、脫蠟等步驟，再分別進(jìn)行HE染色和CD68免疫組化。應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Image Pro Plus 6.0進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)。

4.GM-CSF自身抗體與GM-CSF水平測(cè)定：收集所有小鼠血清，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明依次通過(guò)上樣、加酶、溫浴、洗滌、顯色、終止等步驟，用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(A)值，分析小鼠體內(nèi)GM-CSF自身抗體水平以及GM-CSF水平的差異。

5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：將肺組織液氮冷凍勻漿，予以Trizol裂解提取總RNA，用Nanodrop測(cè)定其濃度。根據(jù)說(shuō)明將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5～10倍后，根據(jù)TaKaRa SYBR green試劑盒的說(shuō)明配置反應(yīng)體系上機(jī)檢測(cè)，以GAPDH作為測(cè)定內(nèi)參。PCR引物序列：mTGF-β：上游引物:5′-CCACCTGCAAGACCATCGAC-3′，下游引物:5′-CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC-3′；m TNF-α：上游引物:5′-ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC-3′，下游引物：5′-GCTTGTCACTCGAATTTTGAGA-3′；mIL-1β：上游引物:5′-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3′，下游引物:5′-TGGATGCTCTCATCAGGACAG-3′。

6.蛋白印跡法:小鼠肺組織液氮冷凍后勻漿，后置于RIPA蛋白裂解液冰上裂解5min，用超聲破碎儀冰浴處理組織使充分裂解，離心后分離上清，取少量樣品進(jìn)行BCA蛋白定量，剩余樣品100℃煮沸5min，-20℃保存?zhèn)溆?。制備SDS-PAGE凝膠，依次經(jīng)過(guò)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、4℃一抗孵育過(guò)夜、二抗孵育，通過(guò)化學(xué)發(fā)光顯影儀顯像，應(yīng)用 Image J軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行灰度定量分析。

結(jié) 果

1.MMF對(duì)博來(lái)霉素吸入后小鼠肺組織炎性因子表達(dá)的影響：MMF灌藥處理后發(fā)現(xiàn)，MMF可以顯著抑制小鼠肺組織炎性因子IL-1β、TNF-α和纖維化指標(biāo)TGF-β的蛋白表達(dá)水平(F=9.30、20.30、18.03，P=0.000)和mRNA水平(F=37.30、23.76、40.90，P=0.000)。其中IL-1β、TGF-β在不同藥物劑量組間(MMF1、MMF2)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.10、2.45，P=0.93、0.06，圖1)。

圖1 不同濃度MMF灌藥對(duì)小鼠肺組織炎癥及纖維化相關(guān)分子蛋白水平的影響A.Western blot法檢測(cè)不同組間炎癥及纖維化相關(guān)分子蛋白表達(dá)的差異；B.定量PCR檢測(cè)不同組間炎癥及纖維化相關(guān)分子mRNA表達(dá)的差異; PBS.用PBS灌胃處理組;MMF1.用濃度為20mg/kg的MMF灌胃處理組;MMF2.用濃度為35mg/kg的MMF灌胃處理組。*P=0.000

2.MMF對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)小鼠肺部間質(zhì)改變的影響:對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示博來(lái)霉素吸入可引起小鼠肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化形成(黑箭頭)，而MMF灌藥處理后可顯著改善上述病理改變(圖2)。

圖2 HE染色檢測(cè)不同濃度MMF對(duì)小鼠肺部病理改變的影響(×40)A.PBS組;B.MMF1組;C.MMF2組;PBS組肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)伴纖維化形成，提示間質(zhì)性肺炎改變(黑箭頭)

3.MMF對(duì)小鼠肺泡巨噬細(xì)胞的數(shù)量的影響:通過(guò)免疫組化法對(duì)小鼠肺組織CD68進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，MMF1組和MMF2組小鼠肺組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量較PBS組明顯減少(F=44.04,P=0.000)，而不同藥物濃度組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖3 免疫組化檢測(cè)MMF對(duì)小鼠肺巨噬細(xì)胞數(shù)量的影響及相對(duì)定量(×5)A.PBS組；B.MMF1組；C.MMF2組；D.各組間CD68陽(yáng)性吸光度值的相對(duì)結(jié)果；CD68標(biāo)記巨噬細(xì)胞(黑箭頭)。* P=0.000

4.MMF對(duì)小鼠血清GM-CSF信號(hào)通路的影響:ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，MMF1組和MMF2組小鼠血清GM-CSF自身抗體及GM-CSF水平與PBS組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.49、0.66，P=0.62、0.53)，且均在正常水平(圖4)。

圖4 ELISA法檢測(cè)不同濃度MMF對(duì)小鼠血清GM-CSF水平(pg/ml)及GM-CSF自身抗體(μg/ml)的影響A.GM-CSF表達(dá)相對(duì)水平;B.GM-CSF自身抗體表達(dá)相對(duì)水平

討 論

免疫介導(dǎo)的肺部病變是風(fēng)濕免疫科醫(yī)生都需要面對(duì)的難題，肺部的損害可能由多種原因引起，比如炎癥通路的異常激活、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、成纖維細(xì)胞的過(guò)度激活、血管內(nèi)皮慢性炎癥損傷等，但具體機(jī)制仍不明確[6]。其病理改變主要呈非特異性間質(zhì)性肺炎樣改變,機(jī)化性肺炎多與其他類型間質(zhì)性肺炎合并存在[7]。以結(jié)締組織病相關(guān)間質(zhì)性肺病為例，免疫抑制劑的應(yīng)用是目前重要的治療手段，CTX和MMF均被大型RCT研究證實(shí)可有效改善肺部癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)[8～10]。筆者從病理改變以及分子層面研究證實(shí)，MMF確實(shí)有改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及纖維化形成的作用，并且可以抑制肺組織內(nèi)炎性因子的表達(dá)水平，在分子層面佐證了MMF對(duì)于治療肺部炎癥和纖維化病變的有效性。

前期筆者在臨床工作中診治了1例接受MMF治療的混合性結(jié)締組織病患者，該患者在用藥半年后出現(xiàn)持續(xù)性咳嗽和進(jìn)行性呼吸困難，肺泡灌洗證實(shí)PAP。PAP是一種罕見的肺部疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難、咳嗽和低氧血癥，肺部CT提示兩肺彌漫性滲出性改變，嚴(yán)重可致呼吸衰竭[11～13]。其典型的肺部病理改變是肺泡表面活性物質(zhì)堆積，從而導(dǎo)致?lián)Q氣功能障礙[14]。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，考慮與肺泡巨噬細(xì)胞功能下降有關(guān)，目前習(xí)慣將其分為原發(fā)性、繼發(fā)性、先天性以及特發(fā)性4種[15，16]。原發(fā)性PAP是指由于GM-CSF信號(hào)通路異常導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞分化成熟障礙，通常是由于GM-CSF自身抗體的存在或者GM-CSF受體突變。繼發(fā)性PAP是指考慮因感染、腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、免疫缺陷性疾病、藥物等因素引起的肺泡巨噬細(xì)胞功能障礙引起肺泡表面活性物質(zhì)的堆積。先天性PAP是由于基因突變引起的表面活性物質(zhì)生成紊亂，而特發(fā)性PAP指無(wú)明確病因或誘因的PAP。根據(jù)日本開展的一項(xiàng)大型的流行病學(xué)調(diào)查，原發(fā)性PAP和繼發(fā)性PAP分別占所有類型的92.0%和7.5%[17]。肺泡灌洗是常用的有效治療手段，但在繼發(fā)性PAP如藥物引起的病例中，及時(shí)停藥則較為關(guān)鍵[18]。

有研究顯示免疫抑制劑如西羅莫司和MMF可導(dǎo)致繼發(fā)性PAP，具體機(jī)制尚不明確，有假說(shuō)推測(cè)是由于MMF抑制了細(xì)胞免疫從而阻礙了淋巴細(xì)胞依賴的巨噬細(xì)胞分化成熟過(guò)程以及巨噬細(xì)胞被招募的過(guò)程[19，20]。筆者研究報(bào)道的該例患者在停用MMF及多次肺泡灌洗后肺部病灶明顯吸收，臨床癥狀消失，ELISA檢測(cè)其血清GM-CSF自身抗體及GM-CSF水平均在正常范圍，因此考慮是由于服用MMF導(dǎo)致的繼發(fā)性PAP。盡管十分罕見，MMF導(dǎo)致PAP的潛在風(fēng)險(xiǎn)值得風(fēng)濕科醫(yī)生的關(guān)注。本研究從小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)MMF確實(shí)有減少肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量的作用，提示可能會(huì)因此與繼發(fā)性PAP的發(fā)生有一定的相關(guān)性，當(dāng)然具體的因果關(guān)系有待于開展進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，本研究認(rèn)為MMF是治療風(fēng)濕免疫疾病相關(guān)肺間質(zhì)病變的有效手段，但該藥物的應(yīng)用會(huì)在一定程度上減少巨噬細(xì)胞數(shù)量，并可能會(huì)因此引起肺泡表面活性物質(zhì)的堆積從而導(dǎo)致PAP的發(fā)生。這為筆者在前期臨床上碰到的病例的診斷與治療提供理論依據(jù)。當(dāng)然，其藥物劑量、持續(xù)使用時(shí)間以及免疫系統(tǒng)疾病狀態(tài)與PAP發(fā)病明確的相關(guān)性則有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。