檸檬酸鉀與TG酶對(duì)牛乳酸凝膠形成的協(xié)同作用

高飛，楊暢, ，李洪亮,

1.蒙牛高科乳制品（北京）有限責(zé)任公司（北京 101100）；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司（呼和浩特 011500）；3.蒙牛乳業(yè)（北京）有限責(zé)任公司（北京 101100）

凝固型酸奶以其獨(dú)特的風(fēng)味、細(xì)膩的質(zhì)地和較高的營養(yǎng)價(jià)值而深受人們的喜愛[1-2]。但是凝固型酸奶在貯藏和運(yùn)輸過程中存在質(zhì)地不穩(wěn)定現(xiàn)象，突出表現(xiàn)為黏度降低、乳清析出和外觀變粗糙等宏觀現(xiàn)象[3]，極大地影響產(chǎn)品的感官性質(zhì)和消費(fèi)者的可接受性[4-5]。

乳蛋白是凝固型酸奶質(zhì)地最重要的構(gòu)筑單元[6]，其包括乳清蛋白和酪蛋白[6-7]，其中酪蛋白在牛乳中是以直徑約150 nm膠束形式存在[6,8]。在菌種的作用下，酪蛋白通過非共價(jià)鍵形成的三維凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)酸奶質(zhì)地的穩(wěn)定性起決定作用[9-10]。TG酶是食品工業(yè)中常用的交聯(lián)劑[11-12]，可通過促進(jìn)酪蛋白分子間的共價(jià)交聯(lián)實(shí)現(xiàn)如凝膠空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的調(diào)控，從而提高凝膠的質(zhì)地特性[13-14]。然而，由于酪蛋白膠束較為致密的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，TG酶難以進(jìn)入膠束內(nèi)部進(jìn)行蛋白間共價(jià)交聯(lián)[15]，因此TG酶處理無法形成交聯(lián)度更高的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，所以酸奶的凝膠強(qiáng)度較低與乳清析出等缺陷無法得到根本改善。

已有研究證實(shí)，鈣離子的螯合劑（如檸檬酸鹽、磷酸鹽）可以使酪蛋白膠束分解為粒徑更小的酪蛋白聚集體[16-17]，這將增加TG酶對(duì)酪蛋白的作用位點(diǎn)，因而可能增加酪蛋白的交聯(lián)度，從而進(jìn)一步改善酸奶凝膠在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過程中的穩(wěn)定性。但是目前尚無關(guān)于鈣螯合劑和TG酶協(xié)同處理來改善脫脂酸乳凝膠質(zhì)地特性的報(bào)道。此次試驗(yàn)以脫脂粉復(fù)原乳為原料，以檸檬酸鉀作為鈣離子螯合劑，研究了檸檬酸鉀和TG酶協(xié)同處理對(duì)脫脂酸乳凝膠質(zhì)地和微觀特性的影響。此次研究將為提高脫脂酸乳凝膠產(chǎn)品的穩(wěn)定性和感官特性提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳，由三河福成生物科技有限公司提供，蛋白質(zhì)含量為3.0%，于4 ℃貯藏；檸檬酸鉀，廣東西隴科學(xué)股份有限公司；TG酶（酶活200 U/g），德國C &P有限責(zé)任公司；復(fù)配菌種（W保加利亞乳桿菌∶W嗜熱鏈球菌=6∶4），美國Dupont公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CT6E日立臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙科美分析儀器有限公司）；Nano ZS納米粒徑分析儀（英國Malvern公司）；TA-XT+質(zhì)構(gòu)儀（英國Stable Micro Systems公司）；MCR302流變儀（奧地利Anton-Paar公司）；S-3000N冷凍掃描電子顯微鏡（日本Hitachi公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 檸檬酸鉀處理脫脂乳

將檸檬酸鉀加到脫脂乳中，使其濃度分別達(dá)到0，5，10，20，30，40和50 mmol/L。用0.5 mol/L的HCl將各組pH調(diào)至6.6。將已分散完全的TG酶溶液按10 U/g乳蛋白的比例分別添加到各組中，25 ℃下磁力攪拌5 min使其分散，然后置于43 ℃的恒溫水浴鍋中1 h，使乳蛋白和TG酶充分作用。

1.3.2 酸乳樣品的制備

將復(fù)配菌種按照0.2 DCU/kg添加到1.3.1中各組樣品中，置于43 ℃的恒溫箱中6 h，最后將樣品于4 ℃保存。

1.3.3 樣品測(cè)試

1.3.3.1 粒徑測(cè)定

將1.3.1中TG酶處理前的樣品用25 ℃的超純水稀釋500倍，利用粒徑分析儀測(cè)定各組樣品的粒徑分布。測(cè)試時(shí)，樣品的環(huán)境溫度為25 ℃，動(dòng)態(tài)光散射光源的散射角度為90°。

1.3.3.2 凝膠的流變學(xué)性能測(cè)定

凝膠的流變特性采用MCR302流變儀進(jìn)行測(cè)定，將發(fā)酵菌種添加到脫脂乳后，迅速轉(zhuǎn)移到流變儀樣品測(cè)試的圓筒中，樣品表面平鋪一層厚度為3 mm左右的植物油，以防止樣品水分的蒸發(fā)。測(cè)試時(shí)的振蕩頻率設(shè)定為0.1 Hz，振幅設(shè)定為1%，以確保測(cè)試所得的數(shù)據(jù)處于線性黏彈區(qū)，測(cè)試溫度保持在43 ℃，凝膠時(shí)間段選取儲(chǔ)能模量G’≥1 Pa的區(qū)域[18]。

1.3.3.3 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定

將1.3.2中的樣品從4 ℃的冰箱取出后，在25 ℃的室溫下放置2 h，待溫度恒定后，置于質(zhì)構(gòu)儀下方，選擇直徑10 mm的探頭，以60 mm/min的速度從接觸樣品表面后勻速下降20 mm，記錄凝膠強(qiáng)度隨下降時(shí)間的變化，將凝膠破裂點(diǎn)的數(shù)值作為凝膠強(qiáng)度[19]。

1.3.3.4 凝膠持水力測(cè)定

按照1.3.2的方法制備樣品，冷卻至室溫后，將樣品置于臺(tái)式離心機(jī)中進(jìn)行離心（2 800g，5 min）。離心后，小心去除水層，按式（1）計(jì)算持水力（WHC）[20]。

式中：M0為離心管的質(zhì)量，g；M1為離心去除水層后樣品和離心管的總質(zhì)量，g；M2為樣品質(zhì)量，g[18]。

1.3.4 凝膠微觀結(jié)構(gòu)的表征方法

微觀結(jié)構(gòu)的表征采用S-3000N冷凍電鏡掃描儀，樣品固定在載樣平臺(tái)后，在-180 ℃的液氮中迅速冷凍，并在-85 ℃下升華35 min，升華結(jié)束后，在樣品表面進(jìn)行噴金處理，噴金時(shí)間為90 s，噴金后，對(duì)樣品表面進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬酸鉀對(duì)脫脂乳顆粒直徑的影響

檸檬酸鉀處理后脫脂乳顆粒直徑的影響見圖1。檸檬酸鉀的濃度越高，脫脂乳中顆粒的尺寸越小，表明檸檬酸鉀能有效降低脫脂乳體系中酪蛋白膠束的粒徑。酪蛋白膠束是由4種蛋白單體（αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白），以及磷酸鈣相互結(jié)合而成的復(fù)合物[21]。其中磷酸鈣在膠束中的主要作用是對(duì)各種蛋白單體進(jìn)行非共價(jià)交聯(lián)，以膠態(tài)存在，也稱膠態(tài)磷酸鈣[22]。而檸檬酸根的鈣離子螯合能力顯著高于磷酸根[23]。因此檸檬酸根能有效螯合酪蛋白膠束中的鈣離子，導(dǎo)致膠態(tài)磷酸鈣的解離，從而導(dǎo)致膠束中各蛋白之間的連接程度降低，直觀表現(xiàn)是脫脂乳中顆粒粒徑顯著減小。

圖1 不同濃度的檸檬酸鉀處理對(duì)脫脂乳中顆粒直徑的影響

2.2 檸檬酸鉀對(duì)脫脂酸奶流變學(xué)特性的影響

在TG酶濃度相同的條件下，不同濃度的檸檬酸鉀處理對(duì)脫脂酸乳的儲(chǔ)能模量G’隨時(shí)間變化的影響見圖2。隨著凝膠時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的儲(chǔ)能模量G’均呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，隨著檸檬酸鉀濃度的增加，儲(chǔ)能模量G’從不添加檸檬酸鉀時(shí)的（16.28±2.13）Pa到檸檬酸鉀濃度為40 mmol/L時(shí)的（108.14±5.58）Pa，儲(chǔ)能模量提高了7倍。通過粒徑的測(cè)試結(jié)果可以看出，檸檬酸鉀可以促使酪蛋白膠束的解離，使膠束內(nèi)部的蛋白單體釋放出來，暴露出更多的酶促反應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)[24]，從而增加凝膠網(wǎng)絡(luò)中共價(jià)鍵的數(shù)量與強(qiáng)度，致使儲(chǔ)能模量增加[25]。隨著檸檬酸鉀濃度的繼續(xù)增大，脫脂乳無法形成凝膠，可能是由于檸檬酸根結(jié)合了大量的氫離子，使體系的pH無法達(dá)到酪蛋白的等電點(diǎn)。

圖2 不同濃度檸檬酸鉀處理對(duì)脫脂酸乳彈性模量隨時(shí)間變化的影響

2.3 檸檬酸鉀對(duì)脫脂酸奶凝膠強(qiáng)度的影響

在TG酶濃度一定的條件下，不同濃度的檸檬酸鉀處理對(duì)脫脂酸奶凝膠強(qiáng)度的影響見圖3。不經(jīng)過檸檬酸鉀處理且無TG酶存在時(shí)所形成的凝膠強(qiáng)度最低，表明TG酶能增加體系的凝膠強(qiáng)度。在0~30 mmol/L范圍內(nèi)，隨著檸檬酸鉀濃度的增加，凝膠強(qiáng)度呈顯著的增加趨勢(shì)；繼續(xù)增加檸檬酸鉀的濃度，凝膠強(qiáng)度未出現(xiàn)顯著的變化。經(jīng)過檸檬酸鉀處理后脫脂乳中顆粒的尺寸更小，能有效地促進(jìn)TG酶與酪蛋白的相互作用，從而增加酪蛋白的共價(jià)交聯(lián)程度，形成更為穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖3 檸檬酸鉀處理對(duì)脫脂酸乳凝膠強(qiáng)度的影響

2.4 凝膠持水力測(cè)定結(jié)果與分析

在TG酶濃度一定的條件下，不同濃度的檸檬酸鉀處理對(duì)脫脂酸乳凝膠持水力的影響見圖4。與空白組相比，僅添加TG酶的組別，持水能力雖有所提高，但無法有效地抑制乳清析出；當(dāng)檸檬酸鉀濃度大于20 mmol/L時(shí)，凝膠的持水力顯著上升，之后基本保持平穩(wěn)的狀態(tài)。這是因?yàn)榻?jīng)較高濃度的檸檬酸鉀處理，脫脂乳體系中的酪蛋白膠束得到充分的解離，酪蛋白與TG酶的結(jié)合位點(diǎn)增多，水分不易從凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中脫除；而不經(jīng)過檸檬酸鉀解離或解離程度不夠，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)就比較松散，在離心的作用下更容易失水而變得不穩(wěn)定。

圖4 不同濃度檸檬酸鉀處理對(duì)脫脂酸乳凝膠持水力的影響

2.5 凝膠微觀結(jié)構(gòu)分析

不同濃度的檸檬酸鉀處理后的各試驗(yàn)組脫脂酸乳凝膠的微觀結(jié)構(gòu)見圖5。圖5（A）表明在無檸檬酸鉀和無TG酶的條件下形成的脫脂酸乳凝膠中幾乎找不到規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)，表明僅依靠酪蛋白分子間的疏水作用和氫鍵等非共價(jià)鍵形成的酸凝膠結(jié)構(gòu)是不穩(wěn)定的；圖5（B~F）是在TG酶存在的條件下，不同檸檬酸鉀處理組形成的脫脂酸乳凝膠結(jié)構(gòu)的微觀結(jié)構(gòu)圖?？梢钥闯?，隨著檸檬酸鉀濃度的增加，形成的三維凝膠的空隙致密程度呈明顯的增加現(xiàn)象，凝膠網(wǎng)格之間斷裂的數(shù)量顯著降低，表明在TG酶存在的條件下，隨著檸檬酸濃度的增加，形成的脫脂酸乳凝膠的穩(wěn)定性呈顯著的增加趨勢(shì)。

圖5 不同檸檬酸鉀濃度處理后脫脂乳凝膠體系微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡圖

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)以TG酶交聯(lián)的脫脂乳凝膠作為研究對(duì)象，研究了檸檬酸鉀的濃度對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響。結(jié)果表明：檸檬酸鉀的濃度越高，脫脂酸乳的強(qiáng)度越大，持水能力越強(qiáng)，穩(wěn)定性越高。檸檬酸鉀改善脫脂酸乳質(zhì)構(gòu)的機(jī)制是：檸檬酸根使脫脂乳中膠態(tài)磷酸鈣解離，促使酪蛋白膠束分解，增加了酪蛋白與TG酶發(fā)生共價(jià)交聯(lián)作用的位點(diǎn)，乳凝膠形成后，由于共價(jià)交聯(lián)位點(diǎn)數(shù)量的增加，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為致密，穩(wěn)定性顯著提高，改善了凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。