桑黃液體培養(yǎng)基優(yōu)化及飲品加工工藝

謝春芹，許俊齊，黃小忠，張雪松，張博士

江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院（句容 212400）

桑黃（Phellinus igniarius）是一類具有重要藥用價值的大型真菌，屬擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、層孔菌屬[1]。學(xué)名鮑氏層孔菌，又稱火木層孔菌、桑臣、桑耳等，子實體無柄，菌蓋扁馬蹄形或半球形，木質(zhì)，淺肝褐色至暗灰色或黑色，是一種寄生于腐爛桑樹上的多年生真菌。桑黃中的活性成分具有抗菌、抗癌、保肝、提高免疫力的功效，是目前國際公認的生物抗癌領(lǐng)域中療效非常好的藥用真菌[2-5]。

桑黃作為一種名貴中藥，富含豐富的多糖類、黃酮類、酚類和萜類等成分[6]。其抑制腫瘤的研究主要集中在具有藥理功能的成分桑黃多糖方面，桑黃的抗癌多糖來源包括子實體多糖、菌絲體及發(fā)酵液多糖。作用機制是通過細胞調(diào)節(jié)和體液免疫來提高機體的免疫力，進而達到抑制腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移的目的[7-9]。

由于受自身生物特性和外界環(huán)境的影響，野生桑黃菌子實體稀少，人工栽培周期長，無法滿足人們對珍稀桑黃菌資源的廣泛需求，對桑黃菌進行人工發(fā)酵培養(yǎng)以獲取桑黃菌絲體為其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供了可能，且發(fā)酵周期短，不受季節(jié)和環(huán)境的限制，發(fā)酵所得菌絲體多糖與子實體多糖功效相當(dāng)[10]。

此次試驗通過對桑黃進行液體深層發(fā)酵培養(yǎng)，分析相應(yīng)碳源、氮源及微量元素對其菌絲干質(zhì)量與總多糖含量的影響。在此基礎(chǔ)上，對桑黃菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配配方進行優(yōu)化，以期為桑黃菌絲新型產(chǎn)品開發(fā)提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑黃，由江蘇食用菌研究所提供；白砂糖、馬鈴薯等，為市售食品級；葡萄糖、磷酸二氫鉀、蛋白胨，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；FA 2104 N分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；DHG-9123 A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；L 520微波爐（合肥榮事達三洋電器股份有限公司）；CH2176電磁爐（杭州九陽生活電器有限公司）；HS-6恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面PDA培養(yǎng)基

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

200 g馬鈴薯切成1 cm3的小塊，倒入1 000 mL的水中，煮沸至變軟，用四層紗布過濾，過濾以后的濾液內(nèi)加入瓊脂葡萄糖，繼續(xù)加熱，不停地攪拌，然后補水至1 000 mL，將桑黃菌接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)6 d。

1.2.2 一級液體培養(yǎng)基

葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，VB10.005%，余量為水。

向250 mL三角瓶中加入100 mL一級液體培養(yǎng)基，進行120 ℃滅菌30 min。接種斜面保存的桑黃菌，置于28 ℃，120 r/min的搖床環(huán)境中培養(yǎng)6 d。

1.2.3 二級液體培養(yǎng)基

馬鈴薯20%，硫酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，VB10.005%，余量為水。

用打孔器從平板中取出5塊直徑5 mm的活化菌種塊，接入液體種子培養(yǎng)基中，在120 r/min，25 ℃，無光的環(huán)境中培養(yǎng)7 d。

1.3 試驗方法

1.3.1 桑黃菌絲飲品加工步驟

1.3.1.1 菌種活化

將桑黃菌種接種到斜面培養(yǎng)基上，在28 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7 d，菌絲可長滿試管。

1.3.1.2 一級搖瓶培養(yǎng)

將經(jīng)過活化的桑黃菌種接種到搖瓶培養(yǎng)基中（500 mL的三角瓶裝液150 mL），一級搖瓶培養(yǎng)條件為接入經(jīng)過斜面培養(yǎng)的桑黃菌種2 cm2，在28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)5~6 d。

1.3.1.3 二級搖瓶培養(yǎng)

將一級搖瓶培養(yǎng)桑黃菌種，接種到搖瓶培養(yǎng)基中進行二級搖瓶培養(yǎng)，在28~30 ℃條件下，培養(yǎng)8 d，所得桑黃菌種為生產(chǎn)搖瓶二級種。

1.3.1.4 發(fā)酵培養(yǎng)

將二級種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，二級種與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)5 d，進行擴大培養(yǎng)，得到一級桑黃菌種。

1.3.1.5 發(fā)酵罐培養(yǎng)

一級桑黃菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵罐培養(yǎng)24~36 h后，過濾，得桑黃菌絲。

1.3.1.6 桑黃菌絲飲品制備

過濾后的桑黃菌絲球于50~55 ℃烘干至恒質(zhì)量，研磨粉碎后過0.15 mm篩。將桑黃菌絲球粉∶水=1∶5進行均質(zhì)研磨，均質(zhì)完成后在桑黃菌絲球混液中加入0.2%纖維素酶，混勻后在38 ℃條件下保溫水解1.5 h，將混合料在100 ℃下殺菌10 min。

將準(zhǔn)備好的桑黃菌絲酶解濾液分別加入溶解完成的果膠及黃原膠，再依次加入復(fù)合膠、鮮柚濃縮汁、蜂蜜、檸檬酸、檸檬酸鈉，后攪拌均勻，最后補水至配方規(guī)定的量；將定容后的料液加熱至沸，趁熱加灌入已滅菌的飲料瓶，壓蓋后105 ℃下殺菌10 min，冷卻后得桑黃菌絲發(fā)酵飲品。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 碳源篩選

用電子天平稱取一定量的葡萄糖和玉米粉，設(shè)置5個濃度梯度：4 g/L+6 g/L，6 g/L+8 g/L，8 g/L+10 g/L，10 g/L+12 g/L和12 g/L+14 g/L。玉米粉先煮沸，后用四層紗布過濾，再把濾液和一定量的葡萄糖裝入有0.6 g蛋白胨，8.0 g麩皮，0.28 g MgSO4和0.6 g KH2PO4的1 000 mL的無菌玻璃容器中攪拌均勻。每個配方重復(fù)3次，分裝至250 mL錐形瓶中，加入100 mL配制好的液體培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌30 min。在無菌條件下冷卻至室溫。

1.3.2.2 氮源篩選

用電子天平稱取定量的蛋白胨和麩皮，設(shè)置濃度0.3 g/L+3.0 g/L，0.4 g/L+4.0 g/L，0.5 g/L+5 g/L，0.6 g/L+6 g/L，0.7 g/L+7 g/L和0.8 g/L+8 g/L。麩皮煮沸后用四層紗布過濾，再將濾液及定量的蛋白胨裝入加有4.0 g葡萄糖，5.6 g玉米粉，0.28 g MgSO4和0.6 g KH2PO4的1 000 mL的無菌玻璃容器中，攪拌均勻。每個配方重復(fù)3次，每個250 mL錐形瓶中加入100 mL液體培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌30 min。在無菌條件下冷卻至室溫。

1.3.2.3 礦物質(zhì)元素篩選

用電子天平稱取定量的MgSO4和KH2PO4，5.6 g玉米粉和8.0 g麩皮，先煮沸，后用四層紗布過濾，再向濾液中裝入加有4.0 g葡萄糖，0.6 g蛋白胨，以及不同濃度梯度的MgSO4和KH2PO4攪拌均勻。MgSO4+KH2PO4濃度梯度為0.6 g/L+6 g/L，0.8 g/L+8 g/L，1 g/L+10 g/L，1.2 g/L+12 g/L和1.4 g/L+14 g/L。每個配方重復(fù)3次，每個250 mL錐形瓶中加入100 mL液體培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌30 min。在無菌條件下冷卻至室溫。

故碳源葡萄糖和玉米粉添加量為4 g/L+6 g/L，6 g/L+8 g/L，8 g/L+10 g/L，10 g/L+12 g/L和12 g/L+14 g/L；氮源蛋白胨+麩皮添加量為0.4 g/L+2.0 g/L，0.5 g/L+3 g/L，0.6 g/L+4 g/L，0.7 g/L+5 g/L和0.8 g/L+6 g/L；微量元素MgSO4和KH2PO4添加量為0.2 g/L+0.5 g/L，0.3 g/L+0.75 g/L，0.4 g/L+1 g/L，0.5 g/L+1.25 g/L和0.6 g/L+1.5 g/L，并以菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量為評價指標(biāo)，試驗重復(fù)3次，取平均值，確定三者最優(yōu)的添加量。

1.3.3 正交試驗

在前期試驗基礎(chǔ)上，判定液體培養(yǎng)基中碳源（葡萄糖+玉米粉）、氮源（蛋白胨+麩皮）及微量元素（MgSO4+KH2PO4）對桑黃液體菌絲生長情況存在顯著影響，從單因素試驗中篩選出的不同水平的葡萄糖+玉米粉、蛋白胨+麩皮、MgSO4+KH2PO4，并設(shè)置一列空白列，進行L9(34)正交試驗，因素及水平設(shè)定見表1。每個處理3次重復(fù)，進行振蕩培養(yǎng)，測定其菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量。

表1 桑黃液體培養(yǎng)基正交L9(34)試驗因素與水平單位：g/L

1.3.4 正交試驗

在前期試驗基礎(chǔ)上，白砂糖、檸檬酸及果膠和黃原膠為影響桑黃菌絲體發(fā)酵飲品的關(guān)鍵因素。設(shè)置白砂糖添加量為2%，4%和6%，設(shè)置檸檬酸添加比例為0.11%，0.13%和0.15%，設(shè)置果膠與黃原膠添加比例為0.08%+0.1%，0.10%+0.2%和0.12%+0.3%，進行L9(34)正交試驗，因素及水平設(shè)定見表2。

表2 桑黃菌絲發(fā)酵飲品L9(34)試驗因素與水平單位：%

1.3.5 指標(biāo)測定方法

1.3.5.1 感官評定

感官評分標(biāo)準(zhǔn)：為了能夠確定桑黃菌絲飲品質(zhì)量，對制得的產(chǎn)品取試樣置于透明玻璃杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態(tài)；用溫開水漱口，品嘗其口感，感受其風(fēng)味為指標(biāo)分五組，每組10人。感官評價由10名具有品評經(jīng)驗的食品專業(yè)同學(xué)進行評價，取其平均值。以100分計對產(chǎn)品進行感官評分鑒定，確定最佳配方。

色澤（0~30分）：色澤黃亮，質(zhì)地均勻，無分層，無沉淀，穩(wěn)定性好。

風(fēng)味（0~30分）：特有香氣純正濃郁，柔和。

口感（0~40分）：飲品酸甜平衡，無異味或苦味，口味醇厚，協(xié)調(diào)柔和。

1.3.5.2 桑黃菌絲體干質(zhì)量測定方法

桑黃菌絲體發(fā)酵液，采用150 μm篩網(wǎng)過濾，將菌絲體用蒸餾水抽濾3次。裁剪無紡布，并記下質(zhì)量M1，將抽濾3次后的菌絲體放在無紡布上，置于DHG-9123 A電熱鼓風(fēng)干燥箱中55°烘干至恒重，再次稱取其質(zhì)量得M2，即得桑黃菌絲體干質(zhì)量M0=M2-M1。

1.3.5.3 總多糖測定

總多糖測定：參照苯酚-硫酸法[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖及玉米粉添加量對桑黃菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量的影響

桑黃菌絲體對于葡萄糖利用率較高，前期能滿足菌絲生產(chǎn)的需要。而玉米粉可被桑黃菌絲緩慢分解，有益于桑黃菌絲后期多糖物質(zhì)的累積。因此，在桑黃液體培養(yǎng)基中加入混合碳源葡萄糖和玉米粉后，隨著添加比例的增加，桑黃菌絲體的干質(zhì)量和總多糖含量增加。葡萄糖和玉米粉對桑黃菌絲體干質(zhì)量和總多糖含量的影響如圖1所示。由圖1可看出，隨著葡萄糖和玉米粉的添加量越來越高，桑黃菌絲體干質(zhì)量先快后慢的升高過程。當(dāng)葡萄糖和玉米粉的添加量10 g/L和12 g/L時，桑黃總多糖含量達到峰值為0.435 g/L，桑黃干質(zhì)量為0.726 g/100 mL；葡萄糖和玉米粉用量分別為12 g/L和14 g/L時，桑黃菌絲體干質(zhì)量和總多糖含量為0.392 g/L和0.732 g/100 mL。最后確定混合碳源的最佳配比是：葡萄糖和玉米粉10 g/L和12 g/L。

圖1 葡萄糖及玉米粉添加量對桑黃菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量的影響

2.2 蛋白胨及麩皮添加量對桑黃菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量的影響

蛋白胨和麩皮屬于有機氮化合物，常被用作微生物培養(yǎng)基中的氮源。此外，麩皮中含有多種維生素和糖類，且價格低廉。圖2為蛋白胨及麩皮添加量對桑黃菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)?shù)鞍纂撕望熎さ奶砑恿繛?.6 g/L+4.0 g/L時，每100 mL液體培養(yǎng)基中菌絲體的干質(zhì)量為0.673 g/100 mL，總多糖含量為0.49 g/L，隨著添加量的增加，菌絲體的干質(zhì)量先增大后減小，總多糖含量達到一定程度后有明顯下降。據(jù)此分析可知，選擇蛋白胨和麩皮0.6 g/L+4.0 g/L為最佳混合氮源培養(yǎng)基。

圖2 蛋白胨+麩皮添加量對桑黃菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量的影響

2.3 MgSO4+KH2PO4添加量對桑黃菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量的影響

MgSO4和KH2PO4添加量對桑黃菌絲體干質(zhì)量及多糖含量的影響見圖3。由圖3分析可知，桑黃菌絲體的干質(zhì)量及總多糖含量隨著MgSO4和KH2PO4添加量的增加呈現(xiàn)先增后減。當(dāng)MgSO4和KH2PO4的添加量為0.5 g/L+1.25 g/L時，菌絲體的干質(zhì)量為0.687 g/100 mL，總多糖含量為0.51 g/L，同比高于其他試驗組。由此分析可知，MgSO4和KH2PO4的最佳添加量為0.5 g/L+1.25 g/L。

圖3 MgSO4+KH2PO4添加量對桑黃菌絲體干質(zhì)量及總多糖含量的影響

2.4 桑黃液體培養(yǎng)基工藝優(yōu)化

2.4.1 正交試驗結(jié)果的極差分析

由表3液體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗表中的R值可知，影響桑黃菌絲干質(zhì)量及總多糖含量的主次順序皆為A＞B＞C，即葡萄糖與玉米粉添加量＞蛋白胨與麩皮添加量＞硫酸鎂與磷酸二氫鉀添加量。根據(jù)液體培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件優(yōu)化的結(jié)果分析得出，優(yōu)化后的配方為A2B2C3及A2B3C3，即葡萄糖與玉米粉添加量為10 g/L+12 g/L，蛋白胨和麩皮添加量0.6 g/L+4.0 g/L（0.7 g/L+5.0 g/L）、MgSO4及KH2PO4添加量為0.6 g/L+1.5 g/L，桑黃菌絲在此配方及環(huán)境條件下生長狀況良好，總多糖含量保持在較高水平。

表3 桑黃液體培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基L9(34)試驗結(jié)果分析

對試驗結(jié)果進行方差分析，即在試驗條件下，葡萄糖與玉米粉添加量對桑黃菌絲總多糖及菌絲體干質(zhì)量影響皆顯著（0.01＜p＜0.05）。蛋白胨和麩皮添加量僅對桑黃菌絲干質(zhì)量影響顯著（0.01＜p＜0.05），MgSO4及KH2PO4添加量對桑黃菌絲總多糖及菌絲體干質(zhì)量影響皆不顯著。

2.4.2 擴大性驗證試驗

獲得優(yōu)化方案A2B2C3及A2B3C3，為進一步確認其在實際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，故以其為條件，即葡萄糖與玉米粉添加量為10 g/L+12 g/L，蛋白胨和麩皮添加量0.6 g/L+4.0 g/L（0.7 g/L+5.0 g/L），MgSO4及KH2PO4添加量為0.6 g/L+1.5 g/L，進行擴大性（中試）驗證試驗，試驗重復(fù)3次，測定其菌絲干質(zhì)量及總多糖含量。經(jīng)試驗，蛋白胨和麩皮添加量為0.7 g/L+5.0g/L，在該條件下桑黃菌絲體干質(zhì)量（0.823±0.014）g/100 mL，總多糖含量為（0.493±0.018）g/L，表明該配方為較佳的桑黃液體培養(yǎng)配方組成。

2.5 桑黃菌絲飲品調(diào)配工藝優(yōu)化

2.5.1 正交試驗結(jié)果的極差分析

桑黃菌絲飲品調(diào)配L9(34)試驗結(jié)果見表4，桑黃菌絲飲品方差分析見表5。

從表4桑黃菌絲飲品調(diào)配工藝的正交試驗結(jié)果中的R值可知，影響其綜合評分的因素主次順序為A＞B＞C，即白砂糖＞檸檬酸＞復(fù)合膠（果膠和黃原膠）。依據(jù)綜合評分的結(jié)果分析可知，優(yōu)化的工藝組合均為A2B3C3，即白砂糖添加量4%、復(fù)合膠（果膠和黃原膠）添加量0.12%+0.3%、檸檬酸0.15%，制得的飲品外觀、口感及風(fēng)味的綜合值評價最好。

表4 桑黃菌絲飲品L9(34)試驗結(jié)果

對試驗結(jié)果進行方差分析，表5數(shù)據(jù)顯示，在試驗條件下，白砂糖添加量與檸檬酸添加量對桑黃菌絲飲品的綜合口感影響顯著（p＜0.05），而復(fù)合膠（果膠和黃原膠）對其影響不顯著（p＞0.05）。

表5 桑黃菌絲飲品方差分析

2.5.2 擴大性驗證試驗

獲得的優(yōu)化方案A2B3C3為試驗第6組試驗，為確認其在實際生產(chǎn)中的可靠性與可行性，以其為條件，即桑黃菌絲飲品調(diào)配配方為白砂糖添加量4%、復(fù)合膠（果膠和黃原膠）添加量0.12%+0.3%、檸檬酸0.15%，進行擴大性驗證試驗，試驗重復(fù)3次，經(jīng)品評后，綜合得分達87.8分，試驗結(jié)果均優(yōu)于正交試驗的6組試驗組，表明該配方為較佳的桑黃菌絲飲品的適宜配方。

3 結(jié)論

對桑黃液體培養(yǎng)基碳源、氮源、礦物質(zhì)添加量進行優(yōu)化，試驗結(jié)果為：蛋白胨和麩皮添加量0.7+5.0 g/L、葡萄糖和玉米粉的添加量為10.0 g/L+12.0 g/L、MgSO4及KH2PO4添加量為0.6 g/L+1.5 g/L時，菌絲干質(zhì)量平均值為（0.823±0.014）g/100 mL，總多糖含量為（0.493±0.018）g/L；在對桑黃菌絲發(fā)酵飲品調(diào)配工藝過程中，通過正交試驗分析得出，最優(yōu)組合為白砂糖添加量4%、復(fù)合膠（果膠和黃原膠）添加量0.12%+0.3%、檸檬酸0.15%，以綜合感官評價認為此配方制得的桑黃菌絲飲品，在保證口感的同時，后期貯藏驗證其穩(wěn)定性也較高。

通過對在最佳工藝條件下制得的桑黃發(fā)酵菌絲飲料進行感官評價，其色澤黃亮，質(zhì)地均勻，無分層，無沉淀，穩(wěn)定性好。特有香氣純正濃郁，柔和。飲品酸甜平衡，無異味或苦味，口味醇厚，協(xié)調(diào)柔和。在保留桑黃菌絲原有的活性功能基礎(chǔ)上，桑黃飲品的風(fēng)味獨特，口感更加細膩，具有良好的市場前景。