超高效液相色譜法測(cè)定飲料中的25種常見和新型食品添加劑

劉 蕓,劉 紅,李志全

(1.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,武漢 430000;2.武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,武漢 430072;3.廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司武漢分公司,武漢 430000)

隨著我國(guó)食品工業(yè)的快速發(fā)展,食品添加劑已成為現(xiàn)代食品工業(yè)的重要組成部分。常用的食品添加劑包括甜味劑(安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、紐甜)、防腐劑(苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、納他霉素)、著色劑(新紅、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅、日落黃、靛藍(lán)、誘惑紅、偶氮玉紅、羅丹明B、堿性橙2、堿性橙22)及生物堿(咖啡因和茶堿),國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760－2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[1]規(guī)定了這些常規(guī)食品添加劑的限量。專利藍(lán)V 是一種可在中國(guó)香港、歐盟、俄羅斯限量使用的著色劑。愛德萬(wàn)甜是一種甜度為蔗糖20 000倍的甜味劑[2],歐洲食品安全局和美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定其每日允許攝入限量分別為5,32.8 mg·kg－1。在國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)2017年10月20日發(fā)布的第8號(hào)公告中,愛德萬(wàn)甜被正式列入可使用的食品添加劑名單中。在食品加工和生產(chǎn)過(guò)程中,一些企業(yè)為了延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期,增加口感和色澤,可能會(huì)過(guò)量添加食品添加劑,這些產(chǎn)品一旦被長(zhǎng)期攝入,將會(huì)損害人體的神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)[3-4],甚至可能致畸、致癌。因此,有必要建立一種準(zhǔn)確、可靠、快速地測(cè)定食品中常規(guī)和新型食品添加劑含量的方法,以監(jiān)控食品中食品添加劑的添加水平,更好地保障消費(fèi)者的健康權(quán)益。

目前,檢測(cè)食品添加劑的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法主要有液相色譜法、氣相色譜法、衍生光譜法以及色譜-質(zhì)譜法[5-11],但其檢測(cè)對(duì)象不包括愛德萬(wàn)甜和茶堿。文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)愛德萬(wàn)甜的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[12]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)[13],檢測(cè)茶堿的方法主要為HPLC[14],但這些方法存在前處理方法不一致和檢測(cè)對(duì)象單一的缺點(diǎn)。為了減少現(xiàn)有檢測(cè)方法帶來(lái)的安全漏洞,填補(bǔ)新型甜味劑愛德萬(wàn)甜、著色劑專利藍(lán)V 和其他常用食品添加劑同時(shí)測(cè)定的空白,本工作建立了UHPLC同時(shí)測(cè)定飲料中25種食品添加劑的方法,以期為食品中添加劑使用情況的篩查以及相關(guān)部門的食品監(jiān)管和執(zhí)法提供技術(shù)支撐和方法儲(chǔ)備。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters H class型超高效液相色譜儀,配光電二極管陣列檢測(cè)器;Milli-Q A10 型超純水機(jī);0.45μm 聚四氟乙烯(PTFE)濾膜。

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜、脫氫乙酸、靛藍(lán)、誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度均為1.00 g·L－1。

日落黃、胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度均為0.500 g·L－1。

對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、愛德萬(wàn)甜、堿性橙2、納他霉素、堿性橙22、羅丹明B單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00 g·L－1,介質(zhì)為甲醇。

新紅、莧菜紅、茶堿、咖啡因、阿斯巴甜、偶氮玉紅、專利藍(lán)V、赤蘚紅、紐甜單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00 g·L－1,介質(zhì)為水。

其他所用標(biāo)準(zhǔn)溶液或混合標(biāo)準(zhǔn)溶液均由上述單標(biāo)準(zhǔn)溶液或單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用相應(yīng)的溶劑逐級(jí)稀釋制得。

莧菜紅的純度為79.80%;茶堿、咖啡因、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、堿性橙2、紐甜等的純度均為100%;羅丹明B 的純度為97.30%;阿斯巴甜的純度為97.70%;偶氮玉紅的純度為92%;專利藍(lán)V 的純度為89.70%;納他霉素的純度為91.30%;新紅的純度為88.90%;赤蘚紅的純度為80%;愛德萬(wàn)甜的純度為97.00%;堿性橙22的純度為99.90%。

甲醇為色譜純;乙酸銨為優(yōu)級(jí)純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫35 ℃;流動(dòng)相A為甲醇,B 為0.02 mol·L－1乙酸銨溶液;流量0.3 mL·min－1;進(jìn)樣量3μL;梯度洗脫程序:0～2 min時(shí),A 由3%升至10%;2～4 min 時(shí),A 由10%升至15%;4～8 min時(shí),A 由15%升至40%;8～16 min時(shí),A 由40%升至85%;16～17 min時(shí),A 由85%降至3%,保持2 min。檢測(cè)波長(zhǎng)見表1。

表1 25種食品添加劑的檢測(cè)波長(zhǎng)Tab.1 Detection wavelengths of 25 food additives

1.3 試驗(yàn)方法

取樣品2.5 g,用50%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液稀釋至25 mL,渦旋振蕩2 min 后超聲提取20 min,用0.45 μm PTFE 濾膜過(guò)濾,濾液供UHPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相和梯度洗脫程序

流動(dòng)相主要由緩沖體系和有機(jī)相組成,緩沖體系主要有磷酸鹽緩沖體系和乙酸鹽緩沖體系。乙酸鹽緩沖體系具有分離效果和水溶性好,且不易在色譜柱上殘留等優(yōu)點(diǎn),因此試驗(yàn)以甲醇-乙酸鹽緩沖體系作為流動(dòng)相,通過(guò)調(diào)整甲醇在流動(dòng)相中的比例來(lái)對(duì)極性相差較大的25種食品添加劑進(jìn)行梯度洗脫,洗脫程序見1.2節(jié)。

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)

按照儀器工作條件在200～800 nm 內(nèi)對(duì)25種添加劑進(jìn)行紫外-可見掃描,所選的檢測(cè)波長(zhǎng)見表1。

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1 濾 膜

濾膜會(huì)不同程度地吸附著色劑,因此試驗(yàn)考察了分別以尼龍、聚醚砜和PTFE 等3種材質(zhì)制備的濾膜(孔徑均為0.45μm)過(guò)濾加標(biāo)樣品時(shí)對(duì)其中25種食品添加劑回收率的影響。結(jié)果顯示:以尼龍膜和聚醚砜膜過(guò)濾時(shí),新紅、莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、偶氮玉紅和赤蘚紅的回收率幾乎為0,說(shuō)明上述添加劑已被濾膜完全吸附;以PTFE 濾膜過(guò)濾后所得的25種食品添加劑的回收率為80.0%～110%。因此,試驗(yàn)選擇用PTFE濾膜過(guò)濾樣品溶液。

2.2.2 提取溶劑甲醇的體積分?jǐn)?shù)

試驗(yàn)考察了甲醇的體積分?jǐn)?shù)分別為0,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%(以水作稀釋劑)時(shí)對(duì)加標(biāo)樣品中25種食品添加劑回收率的影響。結(jié)果顯示,在以不同體積分?jǐn)?shù)甲醇溶液提取時(shí),25 種食品添加劑的回收率為5.3%～117%,其中,以水作為提取溶劑時(shí),醇溶性的堿性橙2、堿性橙22、羅丹明B 回收率為5.3%～16.2%;以甲醇作為提取溶劑時(shí),水溶性的防腐劑和色素類添加劑的回收率為17.5%～36.4%;以50%甲醇溶液作為提取溶劑時(shí),25種食品添加劑的回收率均在80.0%以上。綜合考慮,試驗(yàn)選擇甲醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.3 色譜行為

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下,25種食品添加劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照試驗(yàn)方法測(cè)定25種食品添加劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以各添加劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性參數(shù)見表2。

分別以3 倍、10 倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

表2 25種食品添加劑的線性參數(shù)、檢出限及測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination of 25 food additives

2.5 精密度和回收試驗(yàn)

對(duì)空白茶飲料樣品進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),加標(biāo)量分別為各食品添加劑測(cè)定下限的3,10,20倍,每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。

由表3 可知:25 種食品添加劑的回收率為82.1%～111%,RSD 均小于3.5%,方法的精密度和準(zhǔn)確度均能滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.6 樣品分析

應(yīng)用本方法分析7 種果蔬汁飲料和3 種茶飲料,結(jié)果顯示:在3個(gè)茶飲料中均檢出了咖啡因,檢出量分別為95.3,98.4,124.9 mg·kg－1,推測(cè)與原料茶葉中咖啡因的帶入有關(guān);在1個(gè)果蔬汁飲料中檢出了安賽蜜,檢出量為20.2 mg·kg－1,在2個(gè)果蔬汁飲料中檢出了山梨酸,檢出量分別為15.8,18.9 mg·kg－1。為了驗(yàn)證本方法定性結(jié)果是否準(zhǔn)確,參考文獻(xiàn)[1]方法采用液相色譜-質(zhì)譜法中多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)檢出成分進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,兩種方法的定性結(jié)果相同,說(shuō)明本方法滿足實(shí)際應(yīng)用需求。

本工作建立了UHPLC 測(cè)定飲料中25種常見和新型食品添加劑含量的方法,該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確度高、精密度好,可為食品安全監(jiān)管提供有效保障。