改良處理低溫甘油保存的羊膜對兔角膜堿化學(xué)傷后上皮修復(fù)作用的研究

吳丹 黎玥 吳復(fù)躍 項俊 徐建江

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科 上海 200031；2.上海睿泰生物科技股份有限公司 上海 201114）

羊膜因其促上皮化，抑制炎癥反應(yīng)及纖維化的兩大特點(diǎn)，在眼表重建方面得到廣泛應(yīng)用[1-2]，其適用范圍包括持續(xù)性角膜上皮缺損，眼表酸、堿化學(xué)性燒傷、熱灼傷，角膜潰瘍等[3]。

新鮮羊膜因保存時間短、保存條件要求較高，眼科?？漆t(yī)院取材受到一定限制，同時作為移植的生物樣本，存在微生物交叉感染的可能性，其臨床應(yīng)用受到一定限制。低溫保存羊膜與新鮮羊膜相比，其基本結(jié)構(gòu)相同[4-5]，因其克服了保存不便及可能攜帶病原微生物的問題[6],因此在臨床上逐漸受到廣泛應(yīng)用。改良處理低溫甘油法保存羊膜，是用胰酶及核酸酶處理脫基質(zhì)細(xì)胞及DNA、乙醇及伽馬射線照射滅活病原微生物，以甘油作為穩(wěn)定劑，在低溫保存中起到對羊膜的保護(hù)作用。本研究采用改良處理低溫甘油法保存的羊膜，以角膜堿化學(xué)傷兔作為研究模型，研究此羊膜對兔眼表堿化學(xué)傷后上皮的修復(fù)作用，探討其治療的有效性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 3～5個月齡健康新西蘭兔30只（雌性，2～2.5 kg，購于上海中科院實(shí)驗動物研究所）。

1.2 實(shí)驗方法 改良處理低溫甘油羊膜的制備過程均在無菌條件下進(jìn)行，其制作步驟簡述如下。

（1）羊膜剝離清洗、固定：從胎膜邊緣緩慢剝離羊膜層，用鑷子側(cè)面剝離羊膜毛面凝膠狀物質(zhì)，用無菌注射用水清洗羊膜2～3次；將羊膜光面向上，平鋪在浸潤于無菌注射用水的格柵膜上，排除氣泡，用6-0線沿羊膜四周縫合固定。

（2）酶處理：根據(jù)羊膜面積計算2 000 u/mL TrypLE處理液用量，將羊膜面向下置于TrypLE處理液中，37 ℃震蕩30 min,生理鹽水清洗5次。

（3）滲透壓處理：根據(jù)羊膜面積計算無菌注射用水用量，將羊膜面向下置于無菌注射用水中，2～8 ℃ 放置過夜。

（4）核酸酶處理：配置INDUMY nuclease處理液，根據(jù)羊膜面積計算INDUMY nuclease處理液用量，將羊膜面向下置于INDUMY nulease處理液中，37 ℃震蕩3 h；繼而用生理鹽水清洗5次。

（5）乙醇病毒滅活：將羊膜面向下放入70%乙醇溶液中進(jìn)行病毒滅活（37 ℃，30 min）；繼而用生理鹽水清洗5次。

（6）裁剪：將羊膜剪裁成合適大小，連同格柵膜放入羊膜夾具中，置入含甘油的塑料容器；2～8 ℃過夜，進(jìn)行脫水；脫水后的羊膜（置于夾具中）放入羊膜包裝盒中，加入適量甘油，熱封。

（7）伽馬射線輻照滅菌：伽馬射線照射（25 KGy）滅菌。

1.3 手術(shù)方法 所有實(shí)驗步驟均滿足復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院動物實(shí)驗倫理學(xué)要求。設(shè)置左眼為造模眼。新西蘭兔按1 mg/kg氯胺酮聯(lián)合15 mg/kg甲苯噻嗪肌注麻醉后，術(shù)眼使用0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液進(jìn)行表面麻醉。將直徑為8.5 mm的角膜負(fù)壓環(huán)鉆通過負(fù)壓作用吸附于兔角膜表面，取0.5 mL濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液滴入負(fù)壓環(huán)鉆內(nèi)20 s，繼而用大量林格液沖洗。去除負(fù)壓環(huán)鉆后，再用林格液徹底沖洗角膜。造模結(jié)束后角膜中央損傷區(qū)呈現(xiàn)均勻一致的瓷白色，確認(rèn)造模成功。選取造模成功的新西蘭兔用于實(shí)驗。

將角膜堿化學(xué)傷兔隨機(jī)分為2組，每組15只。A組為實(shí)驗組：化學(xué)傷眼使用改良處理低溫甘油法保存的羊膜進(jìn)行角膜覆蓋術(shù)。B組為空白對照組：化學(xué)傷眼不進(jìn)行羊膜覆蓋術(shù)。手術(shù)方法簡述如下：將羊膜平整地覆蓋于眼表，使用10-0尼龍線行間斷縫合8針，將羊膜固定于距角膜緣2 mm處的淺層鞏膜上，縫合結(jié)束后修剪去除多余羊膜。局部使用氧氟沙星滴眼液滴眼（3次/d）至實(shí)驗結(jié)束。

1.4 觀察指標(biāo) 分別于術(shù)后3、5、7、10、14 d，于裂隙燈顯微鏡下觀察2組堿化學(xué)傷兔的眼表情況，記錄結(jié)膜囊有無分泌物、羊膜是否在位等一般情況。隨后，各組隨機(jī)選取3只造模兔，拆除其眼表羊膜，行眼前節(jié)拍照及角膜上皮熒光素鈉染色，記錄上皮缺損范圍，使用Image J軟件在前節(jié)照中圈出角膜上皮缺損區(qū)域，獲得相應(yīng)的像素面積后，換算為其實(shí)際面積。繼而用空氣栓塞法處死新西蘭兔，沿角膜緣取下角膜，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、染色后行組織病理學(xué)觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 13.0軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用成組t檢驗比較對照組與實(shí)驗組的組間差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 改良處理低溫甘油法保存的羊膜外觀透明性好，與新鮮羊膜的對比如圖1A、B。羊膜的蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin,HE）染色及掃描電鏡檢測如圖1C、D，可見羊膜上皮面致密的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，未見細(xì)胞結(jié)構(gòu)。羊膜柔軟與眼表貼合性好，抗拉伸強(qiáng)度0.3～0.4 Mpa。經(jīng)檢測羊膜無細(xì)菌、病毒、支原體等微生物，無甘油殘留，其安全性好，滿足眼表手術(shù)要求。

圖1 改良處理低溫甘油法保存的羊膜外觀照及組織電鏡照 A.改良處理低溫甘油法保存的羊膜；B.新鮮羊膜。改良處理低溫甘油法保存的羊膜外觀透明度好，與新鮮羊膜相比無明顯差別。C.改良處理羊膜的HE染色；D.改良處理羊膜的掃描電鏡照片，可見羊膜上皮面致密的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，未見細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

堿化學(xué)傷造模后兔角膜水腫，呈灰白色。A組與B組造模后即刻角膜上皮缺損情況相當(dāng)，術(shù)后各觀察時間點(diǎn)見造模眼結(jié)膜充血，角膜呈瓷白色混濁。各觀察點(diǎn)A組均無羊膜溶解、脫落。A組術(shù)后3 d即有2只兔眼角膜上皮完全愈合，B組于術(shù)后14 d角膜上皮仍有不同程度的缺損（圖2）。術(shù)后14 d時，2組兔角膜基質(zhì)渾濁程度未得到改善。

圖2 兔角膜堿化學(xué)傷后前節(jié)照 A、E、I、M和Q分別為A組造模后3、5、7、10、14 d的眼前節(jié)照。B、F、J、N和R分別為A組造模后3、5、7、10、14 d的眼前節(jié)鈷藍(lán)光照。C、G、K、O和S分別為B組造模后3、5、7、10、14 d的眼前節(jié)照。D、H、L、P和T分別為B組造模后3、5、7、10、14 d的眼前節(jié)鈷藍(lán)光照。

2.2 角膜熒光素染色面積 A組和B組于術(shù)后3、5、7、10、14 d的角膜上皮平均缺損面積見表1。造模后3～10 d，A組與B組角膜上皮平均缺損面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。造模后14 d，A組角膜上皮缺損面積小于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-3.371，P=0.028）。

表1 不同時間點(diǎn)兔角膜上皮平均缺損面積 單位：mm2

2.3 組織病理學(xué)觀察 組織病理學(xué)觀察示A組羊膜覆蓋術(shù)后3 d可見完整的角膜上皮，其結(jié)構(gòu)僅為單層上皮細(xì)胞，上皮與基質(zhì)連接不緊密。B組于造模后 3 d中央角膜上皮缺失，基質(zhì)裸露。A組羊膜覆蓋術(shù)后5 d，角膜上皮與基質(zhì)不緊密，部分脫離。B組于造模后5 d角膜表面可見脫離的上皮。A組羊膜覆蓋術(shù)后7、10、14 d可見完整的復(fù)層角膜上皮，基質(zhì)內(nèi)伴有炎癥細(xì)胞浸潤。B組于造模后7、10、14 d角膜上皮仍有部分缺失，上皮覆蓋區(qū)與基質(zhì)連接不緊密，部分脫離（圖3）。

圖3 兔角膜堿化學(xué)傷后光鏡下角膜的組織HE染色（×100）A.羊膜覆蓋術(shù)后3 d可見完整的角膜上皮，僅為單層上皮細(xì)胞，上皮與基質(zhì)接連不緊密。B.B組于造模后3 d中央角膜上皮缺失，基質(zhì)裸露。C.羊膜覆蓋術(shù)后5 d，角膜上皮與基質(zhì)不緊密，部分脫離。D.B組于造模后5 d角膜表面可見脫離的上皮層。E、G和I分別為羊膜覆蓋術(shù)后7、10、14 d，可見完整的復(fù)層角膜上皮，基質(zhì)內(nèi)見炎癥細(xì)胞浸潤。F、H和J分別為B組造模后7、10、14 d，可見角膜上皮仍有部分缺失，上皮覆蓋區(qū)與基質(zhì)連接不緊密，部分脫離。

3 討論

眼表堿化學(xué)傷是以堿性物質(zhì)為主的化學(xué)物質(zhì)所致的腐蝕性眼表損傷。眼表受化學(xué)物質(zhì)損傷后，角結(jié)膜上皮細(xì)胞及基底膜受損，角膜緣及結(jié)膜缺血壞死，眼表微環(huán)境惡化，導(dǎo)致角膜缺氧、營養(yǎng)障礙和劇烈的炎癥反應(yīng)，可誘導(dǎo)角膜新生血管生成，形成血管化角膜、瞼球粘連，是我國嚴(yán)重的致盲性眼病。

在化學(xué)性燒傷的眼表重建中，羊膜移植療效顯著[7-8]。羊膜是富含膠原的無血管基底膜，與角結(jié)膜結(jié)構(gòu)相似[9-10]。羊膜可提供上皮下基質(zhì)微環(huán)境，同時分泌堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）等多種生長因子[11]，有利于角膜上皮細(xì)胞增殖、移行，抑制上皮細(xì)胞凋亡。此外，羊膜可刺激角膜緣干細(xì)胞生長，縮短角膜上皮的愈合時 間[7,12]；其物理性的屏障作用，可保護(hù)新生的角膜上皮免受瞬目時眼瞼的切線力影響，利于眼表上皮化。此外，羊膜含有多種蛋白酶抑制劑，可調(diào)整趨化因子表達(dá)，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞凋亡，從而減輕角膜炎癥反應(yīng)、抑制新生血管形成及角膜溶解，減少瘢痕增生[8,13]，防止化學(xué)傷后瞼球粘連，達(dá)到修復(fù)和重建眼表的目的[14]。

在羊膜選擇方面，主要有新鮮羊膜和凍干羊膜。新鮮羊膜雖然效果好，但保存時間短、保存成本較高，眼科?？漆t(yī)院取材受到一定限制；同時，雖然羊膜取自感染指標(biāo)陰性的供體，但某些微生物感染存在窗口期，移植新鮮的羊膜存在感染的風(fēng)險。各家醫(yī)院在處理羊膜時參照了角膜的處理方法，無規(guī)范統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致最終羊膜質(zhì)量參差不齊。處理過程中僅使用幾種抗生素浸泡羊膜也很難避免微生物的殘留。以上諸多原因限制了新鮮羊膜的臨床應(yīng)用。現(xiàn)今醫(yī)院大多采用低溫甘油保存法來延長羊膜的保存期限。低溫甘油保存羊膜是將羊膜保存于一定比例的甘油/培養(yǎng)基混合液或純甘油 中[1]，于-85～-75 ℃下可保存1～2年[15]。有研究[16-17]表明低溫甘油保存的羊膜在降低翼狀胬肉復(fù)發(fā)率、治療持續(xù)性角膜上皮缺損中與新鮮羊膜相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究采用改良處理低溫甘油法保存的羊膜，使用乙醇及伽馬射線照射（25 KGy）2種方法聯(lián)合滅活病原微生物，有效地保證羊膜的安全性。同時，胰酶及核酸酶的脫細(xì)胞、除去DNA處理提升了羊膜透明度，減少其可能存在的免疫原性。此外，濕態(tài)冷藏保存羊膜，保持了其新鮮度和柔韌性。雖然該處理方法步驟較多，但在使用中羊膜與眼表貼合性好，可減少局部異物感，有助于患者術(shù)后視力的恢復(fù)，且克服了凍干羊膜脆性大、韌性較差、容易撕裂的弊端。

本研究采用改良處理低溫甘油保存的羊膜，觀察其對兔角膜堿化學(xué)傷后上皮的修復(fù)作用，取得較滿意的效果。根據(jù)文獻(xiàn)[18]報道，兔角膜堿化學(xué)傷后48 h角膜上皮可完全修復(fù)，但已修復(fù)的角膜上皮容易脫落。在本研究中造模后第3天僅A組觀察到兔角膜上皮完全修復(fù)，B組未觀察到兔角膜上皮完全修復(fù)，可能是因為本研究中兔角膜上皮損傷面積較大，上皮完全修復(fù)更為困難。HE染色結(jié)果顯示造模后3 d，兔角膜中央僅形成了單層的角膜上皮，并且上皮細(xì)胞與基質(zhì)層之間的連接并不緊密，說明兔角膜上皮損傷早期形成的上皮層容易再次脫落造成角膜上皮的缺損。雖然在造模后3、5、7、10 d，2組間平均角膜上皮缺損面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在14 d時2組間平均角膜上皮缺損面積差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此時HE染色結(jié)果顯示A組形成復(fù)層的角膜上皮結(jié)構(gòu)，且上皮與基質(zhì)之間連接緊密，而B組形成的角膜上皮厚度不一，且上皮與基質(zhì)之間連接不緊密，易造成角膜上皮脫落。在角膜HE切片制作過程中也可能造成角膜上皮的缺失，但脫落的上皮一側(cè)可能仍會與角膜相連或游離于裸露的基質(zhì)附近。本研究中，大部分角膜上皮缺失的圖像中未見到游離的角膜上皮；同時，造模后角膜熒光照也說明存在兔角膜上皮的缺失。這2個結(jié)果互相補(bǔ)充，說明堿燒傷后角膜上皮的缺失及低溫甘油保存的羊膜對其存在修復(fù)作用。雖然組織病理學(xué)的研究結(jié)果屬于描述性結(jié)果，但組間觀察期內(nèi)的病理切片可說明低溫甘油保存的羊膜對兔角膜堿化學(xué)傷后上皮修復(fù)有較好的促進(jìn)作用。此外，術(shù)后14 d時，2組兔角膜基質(zhì)渾濁程度均未得到改善，可能與觀察時間較短有關(guān)。

本文的不足之處：角膜新生血管范圍是評價眼表化學(xué)傷恢復(fù)的指標(biāo)之一，該研究未將新生血管范圍的比較納入研究結(jié)果。因為角膜新生血管的比較需分辨率較高的照片；而目前市面上用于兔麻醉的藥物選擇很少，且一直處于缺藥斷貨的狀態(tài)，麻醉藥物作用的較淺，使兔眼無法充分暴露，無法進(jìn)行角膜周邊新生血管的統(tǒng)計。此外，本研究中使用的羊膜，是在既往羊膜的低溫甘油保存法上做了優(yōu)化改良，是升級產(chǎn)品。這種處理保存方法為首次報道，但只與空白對照組進(jìn)行了對比，與其他新鮮羊膜的療效對比，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，改良處理低溫甘油保存的羊膜能促進(jìn)眼表化學(xué)傷的修復(fù)；同時，其易于保存、運(yùn)輸、使用方便且不存在微生物交叉感染的可能性，值得在眼表重建中推廣應(yīng)用。