寧夏西瓜、甜瓜白粉病病原菌鑒定及抗性種質(zhì)資源篩選

王曉敏，王祿星，宋建宇 ，劉艷 ，高艷明 ，李建設(shè) ，張海英 ，許勇

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏現(xiàn)代設(shè)施園藝工程技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750021；3.寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021；4.寧夏設(shè)施園藝(寧夏大學(xué))技術(shù)創(chuàng)新中心，寧夏 銀川 750021；5.北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京 100097)

近年來(lái)，寧夏西瓜、甜瓜產(chǎn)業(yè)栽培總面積超過(guò)8.6 萬(wàn)hm2，但隨著種植面積的擴(kuò)大，露地及設(shè)施甜瓜白粉病危害日益嚴(yán)重[1].瓜類白粉病是一種在甜瓜、黃瓜、南瓜、西瓜、西葫蘆等瓜類作物上廣泛發(fā)生的世界性病害，已成為瓜類作物綠色生產(chǎn)的主要障礙之一[2-3].該病從苗期到成株均可發(fā)病，主要危害葉片，葉柄和莖蔓[2].在發(fā)病期白粉病菌呈指數(shù)增長(zhǎng)且迅速傳播，使植株葉片大面積枯死，導(dǎo)致西瓜、甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)急劇下降，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[3].危害瓜類白粉病的病原菌主要為蒼耳單囊殼白粉菌Podosphaeraxanthii(原稱Sphaerothecafuliginea，也稱單囊殼白粉菌)和菊科高氏白粉菌Golovinomycecichoracearum(原稱Erysiphecichoraeearum，也稱二孢屬白粉菌)[4].楊靜玲等[5]通過(guò)18S rDNA序列分析將中衛(wèi)壓砂甜瓜的白粉病鑒定到單囊殼屬，李磊福等[6]通過(guò)基于ITS序列分析進(jìn)行分子鑒定，最終確定寧夏溫室內(nèi)甜瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌，但未對(duì)寧夏其他地區(qū)的瓜類白粉病病原菌進(jìn)行鑒定.引起不同國(guó)家和地區(qū)甜瓜白粉病的致病菌其主要生理小種有所不同.至今已發(fā)現(xiàn)單囊殼白粉菌存在11個(gè)生理小種，分別為小種0、1、2U、S、2France、3、4、5、N1、N2、N3和N4，二孢屬白粉菌有2個(gè)生理小種，分別為Race I和Race II[7-8].

自1981年以來(lái)，我國(guó)西瓜、甜瓜病理及育種工作者先后在浙江[9-11]、北京[12]、黑龍江[13-15]、海南[16]、甘肅[17-18]、陜西[19-20]、上海[11，21-22]、吉林[23]、河南[24]、新疆[2,4,25]等地開展了西瓜、甜瓜主產(chǎn)區(qū)的白粉病菌及其生理小種的鑒別工作，基本明確了我國(guó)西瓜、甜瓜白粉病均由P．xanthii引起，主要生理小種至少有2個(gè)，分別為生理小種1和2France，由于我國(guó)氣候類型復(fù)雜，栽培模式多樣，種植品種繁多，造成了不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)生理小種不同[10].因此，全面了解我國(guó)瓜類白粉病菌的生理小種分布還需要一定的時(shí)間和過(guò)程.尤其對(duì)寧夏地區(qū)西瓜、甜瓜白粉病生理小種鑒定尚沒(méi)有全面詳細(xì)的報(bào)道.所以明確寧夏地區(qū)西瓜、甜瓜白粉病菌的生理小種對(duì)于引進(jìn)抗源材料、開展抗病育種及白粉病防治方面均具有重要意義.本研究擬通過(guò)病原菌形態(tài)學(xué)和ITS-rDNA序列、國(guó)際通用瓜類白粉病鑒別寄主對(duì)西瓜、甜瓜白粉病病原菌進(jìn)行鑒定及生理小種鑒定，以期明確引起寧夏地區(qū)西瓜、甜瓜白粉病的病原菌種屬、生理小種的分化、優(yōu)勢(shì)生理小種，并對(duì)寧夏地區(qū)23份甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行離體葉片法抗病性鑒定，為有效開展西瓜、甜瓜白粉病防治與抗白粉病育種提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 西瓜、甜瓜白粉病病原樣本 2019年6月-8月分別從寧夏銀川、中衛(wèi)、中寧、彭陽(yáng)、隆德、涇源、青銅峽、平羅、鹽池、吳忠、海原等11個(gè)地區(qū)西瓜、甜瓜自然發(fā)病的病株上采集白粉病病葉，并于盡快接種在感病甜瓜上進(jìn)行分離純化后的白粉病菌作為病原樣本(詳細(xì)信息見表1).

表1 寧夏地區(qū)西瓜、甜瓜白粉病病原樣本采集信息

1.1.2 感病甜瓜品種 用于白粉病病原菌分離、純化與擴(kuò)繁的感病甜瓜品種為“中原新羊角蜜”.

1.1.3 鑒別寄主 國(guó)際通用的瓜類白粉病生理小種鑒定的一整套13個(gè)甜瓜鑒別寄主Iran H、Topmark、Vedrantais、PMR 45、PMR 5、WMR 29、Edisto 47、PI 414723、MR 1、PI124111、PI124112、PMR 6和Nantais Oblong，均由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供.所有寄主材料在銀川嚴(yán)格套袋自交擴(kuò)繁.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白粉病病原菌的分離純化與擴(kuò)繁 將采集的不同地區(qū)的病葉樣本先用無(wú)菌水洗掉表面灰塵，制成約1×105個(gè)/mL孢子懸浮液，用摩擦法接種到寧夏大學(xué)農(nóng)科實(shí)訓(xùn)基地溫室內(nèi)盆栽種植的中原新羊角蜜甜瓜葉片上，將其放置在溫室內(nèi)搭建的小棚中進(jìn)行擴(kuò)繁保存，每個(gè)小棚中只培養(yǎng)一個(gè)地區(qū)的白粉病菌，嚴(yán)格分離，避免交叉污染.詳見王祿星等[1]的方法.

1.2.2 白粉病病原菌的鑒定

1.2.2.1 孢子形態(tài)觀察 1)分生孢子觀察：用挑針挑取純化后發(fā)病葉片上白粉病病原菌的分生孢子，采用無(wú)菌水懸浮，制作臨時(shí)玻片，每個(gè)地區(qū)的白粉病菌制作5個(gè)玻片，每個(gè)玻片在光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野，每個(gè)視野觀察10個(gè)孢子，用顯微測(cè)微尺測(cè)量分生孢子長(zhǎng)度和寬度，并記錄分生孢子著生狀態(tài)及形狀.參照李金鴻等[26]的方法.2)萌發(fā)管觀察：首先將2%瓊脂水溶液滴至載玻片上，放在下面墊有雙層濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后用挑針挑取少量白粉菌分生孢子于瓊脂液面，置于25 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)48 h后取出，顯微鏡下觀察芽管萌發(fā)，每個(gè)地區(qū)的白粉病菌分別觀察5個(gè)玻片，每個(gè)玻片各選取5個(gè)視野，每個(gè)視野觀察5個(gè)萌發(fā)孢子，顯微測(cè)微尺測(cè)量萌發(fā)管長(zhǎng)度和寬度，并記錄萌發(fā)管著生位置.

1.2.2.2 纖維狀體觀察 用挑針挑取少許病原菌分生孢子于載玻片上的3% KOH液滴中，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察分生孢子是否有纖維狀體，每個(gè)地區(qū)的白粉病菌分別觀察5個(gè)玻片，每個(gè)玻片觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野至少取10個(gè)分生孢子.

1.2.2.3 瓠瓜接種試驗(yàn) 將上述11份甜瓜白粉病菌的分生孢子配制成濃度為1×105個(gè)/mL的孢子懸浮液，通過(guò)刷葉法接種于二葉期瓠瓜上，每個(gè)地區(qū)材料接種5株，接種后置于盛有蒸餾水的塑料桶保濕暗培養(yǎng)24 h，取出放在溫度為20～25 ℃溫室內(nèi)，7～9 d后調(diào)查侵染情況，詳見張艷菊等[27]的方法.

1.2.3 白粉病菌的 ITS序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析 用干凈的軟毛刷從新鮮繁殖的甜瓜葉片表面刷下白粉病菌分生孢子，將其收集于1.2 mL離心管中，按照Biospin真菌提取方法進(jìn)行DNA的提取，對(duì)獲得的白粉病菌基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格的DNA樣品于-20 ℃儲(chǔ)存.采用真菌核糖體通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)體系見表3，PCR反應(yīng)程序見表4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或酶切反應(yīng)產(chǎn)物均于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè).將檢測(cè)之后的基因組DNA樣品送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序.登錄NCBI，blastn對(duì)DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，并選擇部分比對(duì)結(jié)果通過(guò)MEGA-X軟件對(duì)其進(jìn)行聚類分析.

表2 PCR反應(yīng)體系信息表

表3 PCR反應(yīng)程序表

1.2.4 白粉病病原菌的生理小種鑒定

1.2.4.1 鑒別寄主準(zhǔn)備 將13個(gè)鑒別寄主種子催芽后播種于口徑20 cm的育苗缽內(nèi)，每個(gè)苗缽內(nèi)播種8粒同一個(gè)品種，每個(gè)品種種植15個(gè)苗缽，出苗后選取11份長(zhǎng)勢(shì)較好的苗缽分組，每組包括13個(gè)鑒別寄主，一組苗置于一個(gè)小棚內(nèi)，并用塑料薄膜與其他組隔離，避免交叉污染.詳見張波等[23]的方法.

1.2.4.2 鑒別寄主接種鑒定 于鑒別寄主子葉展平期采用孢子懸浮液摩擦法接種，詳見1.2.1，接種5～7 d開始發(fā)病，20 d充分發(fā)病后開始調(diào)查鑒別寄主的抗感反應(yīng)，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照王娟等[12]的方法.

將病情分為 6 級(jí)：0 級(jí)：整個(gè)植株沒(méi)有病斑；1 級(jí)：僅子葉有很少量病斑；2 級(jí)：僅子葉有較多病斑或子葉有病斑，莖上有很少量病斑；3 級(jí)：子葉有很多病斑，莖上有少量病斑；4 級(jí)：子葉和莖上布滿病斑或真葉有病斑；5 級(jí)：植株因感病而死.

計(jì)算病情指數(shù)(DI).DI=100×∑(病級(jí)級(jí)數(shù)×發(fā)病株數(shù))/(5×總株數(shù)).

抗?。?

表4 甜瓜白粉病菌生理小種鑒別寄主及其抗感反應(yīng)[13]

1.2.5 23份甜瓜種質(zhì)資源的離體葉片抗病性鑒定 采用滅菌后的打孔器將23份甜瓜種質(zhì)資源(表9)的第3～4片葉打成1.5 cm葉碟，每個(gè)平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)5片葉碟，用移液槍將濃度約為1×105個(gè)/mL的白粉菌分生孢子懸浮液接種在葉片正面中心，每份種質(zhì)資源接種3個(gè)培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱，白天 25 ℃，晚上 20 ℃、濕度 70%、12 h 光暗交替的條件下培養(yǎng).接種 7 d 后開始觀察記錄，在15～20 d充分發(fā)病后調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù).離體葉片法病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考鄧麗君[25]的方法，詳見表5.計(jì)算病情指數(shù)(DI).DI=100×∑(病級(jí)級(jí)數(shù)×發(fā)病葉數(shù))/(4×總?cè)~數(shù)).根據(jù)病情指數(shù)，對(duì)23份甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行抗感分級(jí)，詳見表6.

表5 離體葉片抗病性鑒定方法病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表6 甜瓜白粉病抗感分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 寧夏不同地區(qū)瓜類白粉病病原菌鑒定

2.1.1 瓜類白粉病病原菌孢子形態(tài)觀察 通過(guò)對(duì)寧夏11個(gè)地區(qū)的瓜類白粉病病原菌分生孢子形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)(圖1，表7)，分生孢子橢圓形，無(wú)色，串生(圖1-A)，分生孢子長(zhǎng)寬范圍在(25.25～38.25)μm×(14.50～22.00)μm，長(zhǎng)寬比為1.26～2.41.分生孢子內(nèi)有明顯的纖維狀體，纖維狀體盤狀、新月形(圖1-B).分生孢子萌發(fā)時(shí)，芽管從分生孢子側(cè)面長(zhǎng)出(圖1-C)，芽管的長(zhǎng)度變化范圍較大(16.00～46.25 μm)，寬度變化范圍相對(duì)較小(5.00～15.75 μm)，并沒(méi)有觀察到白粉病病原菌分生孢子有性狀態(tài).通過(guò)分生孢子形狀、大小、萌發(fā)管長(zhǎng)寬、萌發(fā)管側(cè)生以及孢子內(nèi)部含有發(fā)達(dá)的纖維狀體等特征，初步鑒定引起寧夏11個(gè)地區(qū)的西、甜瓜白粉病的病原菌是蒼耳單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii).

圖1 分生孢子形態(tài)特征觀察(400×)

表7 寧夏不同地區(qū)白粉病病原菌分生孢子形態(tài)特征比較

2.1.2 瓠瓜接種試驗(yàn) 11個(gè)地區(qū)甜瓜白粉病菌接種瓠瓜后，7 d后開始出現(xiàn)白粉病，10 d后表現(xiàn)明顯癥狀(圖2)，說(shuō)明11個(gè)地區(qū)的甜瓜白粉病菌均能侵染瓠瓜.因此可以確定引起寧夏11個(gè)地區(qū)的甜瓜白粉病病原菌為蒼耳單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii).

圖2 瓠瓜接種白粉病菌10 d的葉部癥狀

2.2 寧夏不同地區(qū)瓜類白粉病病原菌ITS序列分析

擴(kuò)增得到寧夏地區(qū)瓜類白粉病菌ITS序列片段長(zhǎng)度約570 bp(圖3).將寧夏地區(qū)瓜類白粉病病原菌rDNA-ITS序列命名為n1.選擇部分BLAST比對(duì)結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，n1與蒼耳單囊殼白粉菌Podosphaeraxanthii的ITS序列聚為一類，同源性為100%，判定寧夏地區(qū)甜瓜上的白粉病菌為蒼耳單囊殼白粉菌Podosphaeraxanthii.

圖3 寧夏地區(qū)西瓜、甜瓜白粉病菌ITS序列擴(kuò)增電泳圖

圖4 基于ITS rDNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 寧夏不同地區(qū)瓜類白粉病病原菌生理小種鑒定

如表8所示，寧夏11個(gè)地區(qū)白粉病病原菌對(duì)Iran H，Topmark，Vedrantais，Nantais Oblong等4個(gè)鑒別寄主均表現(xiàn)為感病，而對(duì)鑒別寄主PMR45，PMR5，WMR29，Edisto47，PI414723，MR1，PI124111，PI124112，PMR6雖產(chǎn)生了不同程度的病斑，但病斑未見擴(kuò)展，且均表現(xiàn)為抗病，與表4中瓜蒼耳單囊殼白粉菌生理小種 1的抗感反應(yīng)表現(xiàn)一致.因此，可以確定此次調(diào)查的寧夏11個(gè)西瓜、甜瓜主要栽培區(qū)的白粉病病原菌生理小種均是蒼耳單囊殼白粉菌的生理小種1，未發(fā)現(xiàn)其他生理小種.

表8 寧夏地區(qū)西瓜、甜瓜白粉病生理小種鑒定結(jié)果

2.4 23份甜瓜種質(zhì)資源離體葉盤白粉病抗病性鑒定

利用離體葉片抗病性鑒定方法對(duì)甜瓜23份種質(zhì)資源的白粉病抗病性進(jìn)行鑒定.如表9所示，1489發(fā)病率與病情指數(shù)均為零，表現(xiàn)為免疫(IM)；1464、Sweet、抗病F-3800表現(xiàn)為高抗(HR)，發(fā)病率低于40%，病情指數(shù)低于10；玉露、美玉25號(hào)、綠洲紅表現(xiàn)為中抗(MR)；天蜜、ND-1、新密45號(hào)表現(xiàn)為抗病(R)；15TZH-16表現(xiàn)為感病(S)；日本蘭網(wǎng)、15TZH-23、15TZH-25、15TZH-39、15TZH-46、15T38、NT-1、TZH-26表現(xiàn)為中感(MS)；15TZH-24、15T41、中原新羊角蜜、15TZH-01表現(xiàn)為高感(HS)，接種15 d后，高感品種的發(fā)病率均高于90%，從發(fā)病程度上看，15TZH-24>15T41>中原新羊角蜜>15TZH-01.抗病類型一致的種質(zhì)資源材料之間的病情指數(shù)無(wú)顯著性差異.

表9 離體葉片抗病性鑒定方法對(duì)甜瓜種質(zhì)資源的白粉病抗病性鑒定(20 d)

3 討論

明確瓜類白粉病菌種屬對(duì)抗病育種至關(guān)重要.目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)甜瓜白粉病病原菌鑒定結(jié)果均表明我國(guó)甜瓜白粉病是P．xanthii所致，不存在其他種.本研究對(duì)寧夏11個(gè)地區(qū)的白粉病樣品分類鑒定，符合屈淑平等[28]對(duì)蒼耳單囊殼白粉菌的形態(tài)描述，分生孢子呈廣橢圓形，內(nèi)含纖維狀體.初步確定寧夏地區(qū)瓜類白粉病的病原菌為蒼耳單囊殼白粉菌.但是白粉菌的種類繁多，個(gè)體多態(tài)性明顯，且其生長(zhǎng)、生理生化特征可能隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定.因此，再進(jìn)一步采用瓠瓜接種試驗(yàn)，張艷菊等[27]認(rèn)為只有單囊殼白粉菌能侵染在瓠瓜上，由此進(jìn)一步明確寧夏地區(qū)瓜類白粉病為蒼耳單囊殼白粉菌.再利用真核生物內(nèi)核糖體rDNA的ITS序列對(duì)甜瓜白粉病菌進(jìn)行分子鑒定，最終明確了寧夏地區(qū)西瓜、甜瓜白粉病均為蒼耳單囊殼白粉菌P.xanthii，這與先前楊靜玲等[5]和李磊福等[6]對(duì)于寧夏中部干旱帶壓砂甜瓜和寧夏溫室甜瓜白粉病病原菌的鑒定結(jié)果一致.

本研究首次通過(guò)國(guó)際通用的標(biāo)準(zhǔn)鑒定體系對(duì)寧夏地區(qū)西瓜、甜瓜白粉菌生理小種進(jìn)行了研究，結(jié)果表明寧夏地區(qū)白粉菌生理小種均為蒼耳單囊殼白粉菌的生理小種1.西瓜、甜瓜白粉病生理小種分化復(fù)雜，我國(guó)已有不少學(xué)者對(duì)不同地區(qū)的甜瓜白粉病生理小種進(jìn)行了研究.在北京[12]、黑龍江[13-15]、海南[16]、甘肅[17-18]、上海[21]、吉林[23]和新疆[24-25]地區(qū)均存在單囊殼白粉菌小種1，但其中北京、海南和吉林地區(qū)以2France為優(yōu)勢(shì)生理小種，浙江地區(qū)主要病原菌由生理小種2引起的[9]，黑龍江還存在生理小種N1和新生理小種[15]，甘肅也發(fā)現(xiàn)存在生理小種7[17].生理小種的快速分化導(dǎo)致新的生理小種很快演替變成優(yōu)勢(shì)生理小種，導(dǎo)致抗性材料難以維持對(duì)白粉病持久抗性，同時(shí)也導(dǎo)致不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)生理小種的不同.因此，今后還需要對(duì)寧夏地區(qū)西瓜、甜瓜白粉病菌生理小種進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，明確整個(gè)寧夏地區(qū)瓜類白粉病的種類及生理小種，為整個(gè)寧夏地區(qū)的瓜類作物生產(chǎn)、種子繁育及白粉病抗病育種奠定基礎(chǔ).

預(yù)防甜瓜白粉病最有效的方法是選育抗病品種，本研究采用離體葉片鑒定方法對(duì)寧夏地區(qū)23份種質(zhì)資源進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果表明，1489、1464、Sweet、玉露、天蜜、ND-1、日本蘭網(wǎng)、15TZH-23、15TZH-39、15TZH-46、15T38、NT-1、TZH-2615T41、中原新羊角蜜、15TZH-01與室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法的鑒定結(jié)果一致[1].抗病F-3800、美玉25號(hào)、綠洲紅、新密45號(hào)比室內(nèi)苗期抗病性鑒定方法的鑒定結(jié)果抗病性高了一個(gè)檔.15TZH-24室內(nèi)苗期抗病性鑒定結(jié)果是感病(S)，而離體葉片鑒定結(jié)果是高感(HS)，高了2個(gè)檔.15TZH-16、15TZH-25離體葉片鑒定方法的鑒定結(jié)果比室內(nèi)苗期抗病性鑒定結(jié)果低了一個(gè)檔.兩種抗病性鑒定方法的病情指數(shù)一致的有16份，占69.57%，7份種質(zhì)資源抗感類型不一致，可能是由于兩種鑒定方法之間的誤差導(dǎo)致.離體葉片抗病性鑒定方法發(fā)病速率快，菌種用量少，環(huán)境因素可控，但葉片易被污染，控制好無(wú)菌條件的前提下，適用于大量材料的鑒定[27-28].因此用離體葉片接種鑒定甜瓜品種的抗病性是可靠的.篩選出免疫材料1份(1489)，高抗材料3份(1464、Sweet、抗病F-3800).此研究結(jié)果為有效防治寧夏甜瓜白粉病和抗白粉病新品種的選育奠定基礎(chǔ).

4 結(jié)論

本文明確了引起寧夏地區(qū)西瓜、甜瓜白粉病的病原菌為蒼耳單囊殼白粉菌(Podosphaeraxanthii)，且其優(yōu)勢(shì)生理小種為小種1.結(jié)果具有一定的代表性，為有效的抗病育種提供科學(xué)依據(jù).