液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定雞蛋中氯霉素殘留及北京地區(qū)膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

周一卉，李香月，商方方，王濤，谷旭

(1.北京市石景山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 石景山 100043；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081)

氯霉素(chloramphenicol，CAP，圖1)，是一種酰胺醇類廣譜抗生素，抗菌效果好且價(jià)格低廉，我國(guó)從20世紀(jì)90年代將其作為飼料添加劑加入動(dòng)物飼料中防治動(dòng)物疾病，用于提高畜牧養(yǎng)殖業(yè)的產(chǎn)量[1-3].隨著氯霉素臨床的廣泛應(yīng)用，再生障礙性貧血、胃腸道不適、免疫力下降等由氯霉素引起的一系列不良反應(yīng)的報(bào)道日漸增多[4-5].2002年，西南農(nóng)業(yè)大學(xué)相關(guān)研究表明，蛋雞在多劑量?jī)?nèi)服氯霉素后，在雞蛋中的藥動(dòng)力學(xué)特征為易吸收，因此在雞蛋中易形成殘留[6]，一旦通過(guò)食物鏈的傳遞，最終進(jìn)入到人體內(nèi)形成富集，將不同程度地對(duì)食用者的身體健康造成損害.

圖1 氯霉素結(jié)構(gòu)

日本、歐盟、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家都已經(jīng)將氯霉素列為禁用藥物.隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，氯霉素的檢出限也逐步降低[7].歐盟在96/23/EC指令中禁止在動(dòng)物上使用氯霉素，動(dòng)物源性產(chǎn)品中氯霉素的最高殘留限量(MRL)為10 μg/kg[8]，檢測(cè)方法設(shè)定最低要求性能限定(MRPL)為0.3 μg/kg[9].2019年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布第250號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定，養(yǎng)殖動(dòng)物禁止氯霉素使用，不得在動(dòng)物性食品中檢出[10].目前，針對(duì)動(dòng)物源性食品中氯霉素檢測(cè)方法[11]有酶聯(lián)免疫吸附法、分子印跡法、分子信標(biāo)法、以及被廣泛應(yīng)用的氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等.葉江雷等[12]應(yīng)用免疫膠體金法檢測(cè)水產(chǎn)品中氯霉素殘留，就如何降低“假陰性”率和提高可靠性，以及如何改進(jìn)前處理過(guò)程提出了建議；張慧潔等[13]建立以氯霉素為模板分子，氧化石墨烯為載體，在碳量子點(diǎn)中摻雜氮、硫元素，采用沉淀法制備氯霉素分子印跡聚合物，并作為熒光探針，對(duì)氯霉素殘留進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為6×10-4μmol/L.

雞蛋蛋液中含有大量蛋白質(zhì)、脂類，相較其他組織雞蛋基質(zhì)更為復(fù)雜，一方面質(zhì)譜檢測(cè)基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)，另一方面目標(biāo)物與蛋白質(zhì)相結(jié)合難以解離，降低提取效率.氯霉素雖然已經(jīng)禁止用于動(dòng)物性食品，但是現(xiàn)行的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法均是針對(duì)動(dòng)物肌肉組織，還未見(jiàn)關(guān)于禽蛋中氯霉素的檢測(cè)方法.基于HPLC-MS/MS方法靈敏度高，定性準(zhǔn)確的特點(diǎn)[14]，本研究建立并優(yōu)化禽蛋中氯霉素殘留的固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SPE-UPLC-MS/MS)分析檢測(cè)方法，以期提高雞蛋中氯霉素殘留風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)方法準(zhǔn)確度和精密度，為雞蛋中氯霉素膳食暴露進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITYTMUPLC超高壓液相色譜、Xevo TQ 三重四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(美國(guó)Waters公司)；BS 224 S分析天平(0.1 mg～220 g,德國(guó)Sartorius公司)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Multi Reax渦旋混勻儀(德國(guó)Heidolph公司)；14 000 r/min冷凍離心機(jī)(3-30ks,德國(guó)Sigma公司)；氮吹儀(TTL-DCII型,上海德兆儀器儀表有限公司)；HLB固相萃取柱(3 cc,60 mg,美國(guó) Waters公司).

1.2 試劑

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥99.8%， 德國(guó) Dr.Ehrenstorfer 公司)；氯霉素-D5同位素內(nèi)標(biāo)(純度≥95%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司)，乙酸乙酯(色譜純，美國(guó)Dikma公司)；甲酸、氨水(色譜純，美國(guó)MREDA公司)；氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉(分析純，西亞化學(xué)科技(山東)有限公司)；鹽酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；純水處理終端機(jī)(Milli Q,美國(guó)Millipore公司).

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取氯霉素及氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)，用甲醇作為溶劑，配制1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存于-20 ℃冰箱.用10%甲醇水分別將氯霉素和氯霉素-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為100 μg/L標(biāo)準(zhǔn)使用液，準(zhǔn)確移取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液2、5、10、50、100、200、500、1 000 μL至10 mL容量瓶中，加入200 μL同位素內(nèi)標(biāo)使用液，用10%甲醇水定容至刻度線，配制濃度范圍0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列，臨用現(xiàn)配.

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的采集 雞蛋樣品隨機(jī)采購(gòu)于北京市各區(qū)縣商超、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)等，3年共計(jì)采購(gòu)170批次(表1).

表1 2016～2020 年北京市售雞蛋中氯霉素監(jiān)測(cè)情況

1.4.2 樣品的提取與凈化 根據(jù)氯霉素在堿性條件下可被乙酸乙酯萃取的特點(diǎn)，本研究同時(shí)比對(duì)了液液萃取法(LLE)和固相萃取法(SPE)的提取凈化效率.

SPE法：將雞蛋破殼后混勻蛋液，準(zhǔn)確稱取5.00 g(精確到0.01 g)待測(cè)液體試樣于50.0 mL離心管中，加入100 μg/L同位素內(nèi)標(biāo)工作液40 μL.加入5 mL 4% NaCl溶液和5 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取5 min，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋混勻，以10 000 r/min離心2 min，取上層有機(jī)相，待固相萃取凈化.

HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL 水活化平衡.加入5 mL樣品有機(jī)相提取液至HLB柱內(nèi)，待樣品過(guò)柱后，用5 mL水淋洗，用5 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，在50 ℃下用氮?dú)獯蹈?，再加? mL 10%甲醇/水溶液混勻超聲 1 min，10 000 r/min離心后上清液過(guò) 0.22 μm濾膜，用UPLC-MS/MS 分析氯霉素.

LLE法：在待測(cè)樣液中加入5 g無(wú)水硫酸鈉后，用15 mL乙酸乙酯，0.45 mL氫氧化銨，反復(fù)提取3次，合并上清液，定容后取一定量用正己烷去除脂類，氮?dú)獯蹈?，殘留物? mL 10%甲醇/水溶液混勻超聲1 min，10 000 r/min離心后上清液過(guò)0.22 μm濾膜，供儀器檢測(cè).

1.5 色譜和質(zhì)譜檢測(cè)條件

1.5.1 色譜條件 Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱溫35 ℃，進(jìn)樣體積為5 μL，梯度洗脫，流動(dòng)相A為水和0.1%甲酸水(V/V)進(jìn)行比對(duì)，流動(dòng)相B分別選擇了乙腈、甲醇進(jìn)行比對(duì)，流速為0.25 mL/min.洗脫程序?yàn)?0～0.5 min,90%～90% A;0.5～2.0 min,90%～10% A;2.0～3.0 min,10%～90% A;3.0～3.5 min,10%～90%A;3.5～5.0 min,90%A.

1.5.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；ESI-模式；毛細(xì)管電壓0.5 kv，離子源溫度150 ℃，脫溶劑溫度400 ℃.氯霉素定性定量離子對(duì)及相關(guān)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2.

表2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析參數(shù)

1.6 添加回收實(shí)驗(yàn)

對(duì)24份空白雞蛋樣本，分別在定量限，4倍定量限，10倍定量限，20倍定量限，40倍定量限和50倍定量限6個(gè)濃度水平開展加標(biāo)回收及精密度試驗(yàn)，每個(gè)濃度4個(gè)重復(fù).

1.7 數(shù)據(jù)處理方法

樣品中的氯霉素含量用式(1)計(jì)算得出，其中X為樣品中氯霉素殘留量(μg/kg)；V為測(cè)試液定容體積(mL)；m為測(cè)試液所代表的樣品質(zhì)量(g)，A為樣品溶液中氯霉素的峰面積；Ai為樣品溶液中氯霉素內(nèi)標(biāo)物的峰面積；Ci為樣品溶液中氯霉素內(nèi)標(biāo)的濃度(μg/L).

(1)

1.8 居民雞蛋中氯霉素膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法

1.8.1 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)來(lái)源 雞蛋中氯霉素殘留量(μg /kg)采用試驗(yàn)測(cè)定數(shù)據(jù)；目標(biāo)人群平均體質(zhì)量(kg)采用2014年北京市國(guó)民體質(zhì)監(jiān)測(cè)結(jié)果公報(bào)[13]中發(fā)布的各年齡及性別人群的體質(zhì)量，見(jiàn)表4；雞蛋消費(fèi)數(shù)據(jù)來(lái)源于北京地區(qū)居民膳食調(diào)查[14].

1.8.2 膳食暴露量評(píng)估 通過(guò)食用被污染的食物是人群暴露的主要途徑，本試驗(yàn)以雞蛋為單一的氯霉素暴露途徑，以安全指數(shù)[15]進(jìn)行慢性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，安全指數(shù)IAPSC依照式(2)計(jì)算；EDIC為危害物日攝入量(μg/kg).本著風(fēng)險(xiǎn)最大化原則，本研究采用試驗(yàn)測(cè)得的氯霉素殘留最大量與北京地區(qū)居民每日雞蛋攝入量的乘積作為危害物日攝入量，進(jìn)行測(cè)評(píng)；SIc為安全攝入量(μg/kg))，根據(jù)不同的危害物可采用ADI、PTWI、RDI或RfD等數(shù)據(jù)；f為校正因子，如果安全攝入量采用ADI、RDI或RfD等以日攝入量為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)時(shí)f=1，如果安全攝入量采用PTWI等周攝入量為基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)時(shí)f=7.mB為體質(zhì)量(kg).當(dāng)IAPSC遠(yuǎn)小于1時(shí)，安全；IAPSC小于等于1時(shí)，風(fēng)險(xiǎn)可接受；當(dāng)IAPSC大于1時(shí)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)入風(fēng)險(xiǎn)管理的預(yù)警程序中.

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用Waters-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(ESI 源) ，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM) 模式下對(duì)氯霉素(相對(duì)分子質(zhì)量為 323.14)的質(zhì)譜條件進(jìn)行選擇優(yōu)化.在負(fù)離子模式下，氯霉素進(jìn)入一級(jí)質(zhì)譜后，產(chǎn)生穩(wěn)定的[M-H]-分子離子峰，得到 m/z 為321.16的母離子，符合含有兩個(gè)Cl原子9∶6∶1的豐度比特點(diǎn).氯霉素二級(jí)質(zhì)譜的特征碎片m/z 為 151.89和256.90(圖2)，321.16/151.89碎片離子強(qiáng)度更高，因此將其作為定量離子，二者豐度比為2∶1.

圖2 氯霉素質(zhì)譜圖

2.2 色譜條件的優(yōu)化

分別比較了乙腈和甲醇2種流動(dòng)相條件，并加入甲酸改性，進(jìn)行梯度洗脫時(shí)氯霉素的響應(yīng)及分離度.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以乙腈為有機(jī)相，氯霉素的色譜峰有明顯的拖尾；以甲醇為有機(jī)相時(shí)得到色譜峰峰形更為對(duì)稱、峰寬更窄；在有機(jī)相和水相中同時(shí)添加 0.1%甲酸可以使色譜峰峰形更為尖銳，且響應(yīng)強(qiáng)度更高，見(jiàn)圖3.

A:乙腈-水；B:0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水；C:0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水.

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

雞蛋的基質(zhì)中含有大量的蛋白質(zhì)和脂類，且呈現(xiàn)液體狀態(tài)，待測(cè)物與蛋白質(zhì)相結(jié)合溶于蛋液中，難于解離，提取效率低，質(zhì)譜分析時(shí)基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重，凈化條件復(fù)雜，然而過(guò)于繁瑣的凈化過(guò)程也會(huì)造成目標(biāo)待測(cè)物提取效率的降低，影響方法的準(zhǔn)確性.

分別應(yīng)用兩種方法選取線性范圍中段濃度，10倍定量限和15倍定量限，開展加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4.經(jīng)過(guò)對(duì)照試驗(yàn)，固相萃取法試驗(yàn)回收率更好，步驟更為簡(jiǎn)單，使用更少的溶劑，對(duì)環(huán)境的污染更小，故本研究最終采用固相萃取法進(jìn)行樣品前處理.

圖4 不同凈化方式對(duì)雞蛋中氯霉素回收率的影響

試驗(yàn)采用了空白提取液加入標(biāo)準(zhǔn)的方法，比較了兩種方法的基質(zhì)效應(yīng).分別測(cè)定2種方法雞蛋空白基質(zhì)提取液加標(biāo)1.0 μg/L與同濃度純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)值，通過(guò)兩者的比值評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)(ME).ME<0.8說(shuō)明基質(zhì)對(duì)于待測(cè)物有很強(qiáng)的抑制作用；0.81.2說(shuō)明基質(zhì)對(duì)于待測(cè)物有增強(qiáng)作用.SPE提取法ME在0.95～1.01之間，LLE提取法ME在0.82～0.89之間，結(jié)果表明兩種方法基質(zhì)效應(yīng)均不明顯，但是SPE提取法更優(yōu)，說(shuō)明HLB固相萃取柱能更加有效的去除雞蛋基質(zhì)中的脂類及蛋白質(zhì).

2.4 線性關(guān)系、回收率、精密度及質(zhì)量控制

以氯霉素與氯霉素內(nèi)標(biāo)峰面積比值與內(nèi)標(biāo)濃度乘積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.計(jì)算公式見(jiàn)式(3)，其中A、Ai、C、Ci同式(1).根據(jù)式(3)求得標(biāo)準(zhǔn)曲線a和b，以及相關(guān)系數(shù)r.標(biāo)準(zhǔn)系列溶液按照濃度由低到高依次進(jìn)樣檢測(cè)，在0.1～5 μg/L范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，線性方程為Y=854.44X-62.86，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5，檢出限為0.008 μg/kg，定量限為0.02 μg/kg.對(duì)雞蛋樣本添加6種濃度水平，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每種進(jìn)行4個(gè)水平測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3所示.

表3 氯霉素的回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差

(3)

2.5 不同人群的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

根據(jù)北京地區(qū)居民膳食調(diào)查[14]，雞蛋的日均攝入量為39.3 g/d，由于蛋殼作為非可食用部分，在雞蛋質(zhì)量中占比較少，故忽略不計(jì)，因此，EDIC值為0.055 μg/d(試驗(yàn)獲得雞蛋中氯霉素殘留最大值1.4 μg/kg與0.039 3 kg/d的乘積).世界衛(wèi)生組織以及聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織[16-17]未規(guī)定氯霉素安全攝入量限值(JECFA 和JMPR認(rèn)為添加劑的估計(jì)攝入量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于任何以常規(guī)方法確定的數(shù)值)，同樣，我國(guó)也沒(méi)有對(duì)氯霉素安全攝入量做出規(guī)定；歐洲食品安全局[18]公布?xì)W洲各國(guó)氯霉素慢性膳食暴露限值為幼童11～17 ng/(kg·d)，成人2.2～ 4.0 ng/(kg·d)，本著風(fēng)險(xiǎn)最大化原則，SIC選用低限進(jìn)行研究，幼童11 ng/(kg·d)，成人2.2 ng/(kg·d).安全攝入量采用日均值，因此校正因子f為1.代入式(2)，計(jì)算得出北京地區(qū)不同年齡段，不同性別居民針對(duì)雞蛋中氯霉素膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)安全指數(shù)見(jiàn)表4.

A：2 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液；B： 2 μg/L空白加標(biāo)樣品；C：1 μg/L陽(yáng)性樣品；D：空白樣品.

表4 氯霉素在雞蛋中的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中氯霉素的方法，同位素內(nèi)標(biāo)法定量，降低了質(zhì)譜分析過(guò)程中基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，無(wú)內(nèi)源性干擾.方法穩(wěn)定性好，準(zhǔn)確性高，回收率比較理想，完全可以滿足目前風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)工作檢測(cè)要求.通過(guò)對(duì)2016、2018和2020年北京市市售雞蛋的監(jiān)測(cè)，雞蛋中氯霉素在居民膳食暴露中風(fēng)險(xiǎn)較低，對(duì)3～6歲和20～69歲不同人群膳食暴露的風(fēng)險(xiǎn)均在可接受范圍內(nèi).